Calcium-Dependent Activator Protein for Secretion Function in Murine Dorsal Root Ganglion Neurons

Abstract

Dorsal root ganglion (DRG) neurons transmit sensory information to the central nervous system through glutamatergic synaptic transmission that can be modulated by diverse neuropeptides packaged in large dense core vesicles (LDCVs). LDCVs fuse at the cell somata and in afferent terminals along with synaptic vesicles, in response to a specific stimulus. Cultured DRG neurons are an appropriate system to investigate the role of Calcium-dependent Activator Protein for Secretion (CAPS) in the release machinery of these two different types of vesicles. CAPS has two isoforms that are known to be localized to different neurons in brain and DRGs. Hence DRG neurons are a good model to assess any possible differential roles of CAPS isoforms in LDCV and SV release. LDCV secretion can be studied in isolation or simultaneously with SV secretion once the DRG neurons are co-cultured with the spinal neurons. Using RT-PCR, western blot and immunocytochemistry, we verified that both CAPS isoforms are expressed in DRGs. CAPS1 is expressed in all neurons while CAPS2 is present in half of the population. We visualized NPY-Venus labeled LDCVs in real time using total internal fluorescence reflection microscopy. LDCV release was stimulated by a field electrode inducing secretion in fifty percent of neurons. Double gene deletion of CAPS1 and 2 strongly reduced the number of secreting cells and significantly reduced the amount of exocytosed LDCVs per responding cell in comparison to control. Furthermore, CAPS1 or 2b overexpression raised the number of WT secreting neurons by 20%, and the responding cells released more than twice as many LDCVs in comparison to wild type (WT) controls. Since the density of LDCVs at the plasma membrane was not affected by CAPS expression level, our results indicate that CAPS is a priming factor for LDCVs in DRG neurons. Further investigation of secreting WT cells revealed that only peptidergic neurons secrete LDCV upon stimulation. Interestingly, Isolectin GS-IB4 (iB4) staining together with anti-CAPS2 antibody staining showed that eighty percent of peptidergic neurons express CAPS2. Overexpressing CAPS2b in non-peptidergic neurons induced secretion while CAPS2 KO neurons didn’t secrete LDCVs. This strongly suggest that CAPS2 is the priming factor for LDCV release in WT DRG neurons. To address a possible role of CAPS in synaptic transmission we established DRG neurons co-cultured with spinal neurons (DRG/S neuron) to allow synapse formation. SypHy Lentivirus-based transfection was used to specifically label SVs and visualize their exocytosis. We found that CAPS1 but not CAPS2 promotes synaptic transmission. Upon CAPS1 but not CAPS2 deletion, synaptic transmission is dramatically decreased. Surprisingly, in-depth analysis of the synaptic transmission suggested that CAPS2 indirectly affects synaptic transmission through peptide release. CAPS2 induced an unsynchronized secretion phenotype, while its absence synchronized synaptic transmission. Interestingly, blocking the receptors for the three major peptides, calcitonin gene-related peptide (CGRP), substance P (SP) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), led to the silencing of the majority of active synapses and induced synchronized synaptic transmission in the remaining active synapses. This suggests that the peptide antagonism might induce long-term depression, possibly by altering presynaptic calcium. Taken together, these findings indicate that CAPS isoforms play differential roles due to their differential localization. CAPS2 is localized to DRG cell bodies and primes LDCV secretion, while CAPS1 is localized to synapses and primes SV secretion. Additionally, CAPS2 affects synaptic transmission by promoting the release of peptides which modulate SV fusion. We conclude that CAPS is an indispensable protein with multiple functions that regulate both LDCV secretion and synaptic transmission in dorsal root ganglions.

Spinalganglion (Eng: Dorsal Root Ganglion (DRG)) -Neurone übertragen sensorische Informationen an das zentrale Nervensystem durch eine glutamaterge synaptische Transmission, die durch verschiedene Neuropeptide moduliert werden kann und in großen dichten Kernvesikeln (Eng: Large Dense Core Vesicles (LDCVs)) verpackt sind. LDCVs werden als Reaktion auf einen spezifischen Stimulus an den Soma und in afferenten Termini zusammen mit synaptischen Vesikeln exocytiert. Die Spinalganglion Kultur ist ein geeignetes System, um die Rolle des Calcium-dependent Activator Protein for Secretion (CAPS) in der Freisetzung zweier unterschiedlichen Arten von Vesikeln zu untersuchen. CAPS hat zwei Isoformen, die bekanntermaßen auf verschiedene Neuronen im Gehirn, und in DRGs lokalisiert sind. Daher sind DRG Neurone ein perfektes Modell, um mögliche Rollen der CAPS Isoformen in der LDCV und SV (Synaptic vesicle) Freisetzung zu bewerten. Die LDCV-Sekretion kann isoliert oder gleichzeitig mit der SV-Sekretion untersucht werden, sobald die DRG-Neuronen mit den Spinalneuronen co-kultiviert werden. Unter Verwendung von RT-PCR, Western-Blot und Immunzytochemie konnten wir nachweisen, dass beide CAPS Isoformen in DRGs exprimiert werden. CAPS1 wird in allen Neuronen exprimiert, während CAPS2 nur in der Hälfte der Population vor liegt. Mit Hilfe des Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskopie konnten NPY-Venus (Eng: NeuropeptideY (NPY)) markierte LDCVs in Echtzeit visualisiert werden. Die Freisetzung wurde durch eine Feldelektrode stimuliert, die eine Sekretion in fünfzig Prozent der Neurone induzierte. Die doppelte Gendeletion von CAPS1 und 2 verminderte die Anzahl der sekretierenden Zellen stark und verringerte signifikant die Menge der exocytosierten LDCVs pro Reaktionszelle im Vergleich zur Kontrolle. Darüber hinaus erhöhte CAPS1 oder 2b Überexpression die Anzahl der WT (Wildtyp) sezernierenden Neurone um 20%, und die reagierenden Zellen setzten mehr als doppelt so viele LDCVs frei im Vergleich zu WT Kontrolle. Da die Dichte der LDCVs an der Plasmamembran nicht durch das Expressionsniveau von CAPS beeinflusst wurde, legen unsere Ergebnisse nahe, dass CAPS ein Priming faktor für LDCVs in DRG Neuronen ist. Eine weitere Untersuchung des Prozentsatzes an sekretierenden WT Zellen ergab, dass nur peptiderge Neurone nach Stimulation LDCV sekretieren. Interessanterweise zeigte eine Antikörperfärbung von Isolectin GS-IB4 (iB4) zusammen mit anti-CAPS2-Antikörperfärbung, dass achtzig Prozent peptiderger Neurone CAPS2 exprimieren. Überexpression von CAPS2b in nicht-peptidergen Neuronen induzierte Sekretion, während CAPS2 KO (Knockout) Neurone keine LDCVs sekretierten. Dies deutet stark darauf hin, dass CAPS2 der Priming faktor für die LDCV Freisetzung in WT DRG Neuronen ist. Um eine mögliche Rolle von CAPS bei der synaptischen Übertragung zu untersuchen, haben wir DRG Neurone mit spinalen Neuronen (DRG/S Neuron) co-kultiviert, und somit Synapsenbildungen ermöglich. Eine SypHy (Synaptophysin Phluorin) Lenti-Virus basierte Transfektion wurde verwendet, um Synaptische Vesikel spezifisch zu markieren und ihre Exocytose zu visualisieren. Wir konnten zeigen, dass CAPS1, aber nicht CAPS2 die synaptische Übertragung fördert. Bei CAPS1, aber nicht CAPS2 deletion, wird die synaptische Übertragung drastisch verringert. Überraschenderweise zeigte eine eingehende Analyse der synaptischen Transmissionsexperimente, dass CAPS2 indirekt die synaptische Transmission durch Peptidfreisetzung beeinflusst. CAPS2 induzierte einen asynchronen Sekretions Phänotyp, während dessen Abwesenheit zu einer synchronisierten synaptische Übertragung führte. Interessanterweise führte die Blockierung von drei Hauptpeptiden, einschließlich Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), Substance P (SP), und Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), zum silencing der Mehrheit der aktiven Synapsen und induzierte synchronische synaptische Übertragung in den verbleibenden aktiven Synapsen. Dies deutet darauf hin, dass die Peptidblockade eine Langzeit-Depression induzieren könnte, indem sie wahrscheinlich präsynaptisches Calcium verändert. Zusammengenommen zeigen diese Befunde, dass CAPS Isoformen aufgrund ihrer differentiellen Lokalisation differentielle Rollen spielen. CAPS2 ist in DRG Zellkörpern lokalisiert und ist für das Priming und die Sekretion von LDCV verantwortlich, während CAPS1 sich in Synapsen befinded und das Priming und Sekretion von SVs durchführt. Zusätzlich beeinflusst CAPS2 die synaptische Transmission durch die Förderung der Freisetzung von Peptiden, die an ihren präsynaptischen Rezeptor binden, wodurch die SV Exozytose induziert wird. Wir fassen zusammen, dass CAPS ein leistungsfähiges unentbehrliches Protein mit Multifunktionen ist, das sowohl die LDCV Sekretion als auch die synaptische Transmission auf unterschiedliche Weise regulieren.