Charakterisierung der Eigenschaften von Fibroblasten aus Morbus Dupuytren in Mono- und Co-Kultur

Abstract

Beim Morbus Dupuytren handelt es sich um eine Fibromatose der Palmaraponeurose, die zu einer Beugekontraktur der Finger führt. Die Entstehung der Flexionskontraktur ist multikausal und ist sowohl von genetischen Prädilektionsfaktoren, dem Vorhandensein internistischer Erkrankungen als auch von Umwelteinflüssen abhängig. Die wechselseitige Beeinflussung von Fibroblasten aus Morbus Dupuytren, den sog. Dupuytrenfibroblasten und Endothelzellen durch direkte Zell-Zell-Interaktion und über die Zytokinregulation wird bei der Entstehung des Morbus Dupuytren diskutiert. Als pathognomonisch gilt das gehäufte Vorkommen von Myofibroblasten im palmaren Bindegewebe von Patienten mit einem Morbus Dupuytren. Myofibroblasten tragen über den kontraktilen Apparat zur Ausbildung der typischen Kontrakturen eines oder mehrerer Finger bei. Im Rahmen einer partiellen Fasziektomie bei Patienten mit einem Morbus Dupuytren wurden Dupuytrenfibroblasten isoliert und sowohl in Mono-Kultur als auch in Co-Kultur zusammen mit humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen kultiviert. Mit dem in dieser Arbeit verwendeten Co-Kultur-Wounding-Modell wurden unterschiedliche Charakteristika von Dupuytrenfibroblasten gegenüber normalen humanen dermalen Fibroblasten in Bezug auf die Parameter Migration, Proliferation, myofibroblastoide Differenzierung, Apoptose, Platelet-Derived Growth Factor AA- und Zytokin-Freisetzung nach Normoxie und Hypoxie herausgearbeitet. Durch Fixierung der Zellen an Tag 0, nach 24 h Normoxie bzw. Hypoxie und nach 48 h Normoxie bzw. Hypoxie mit anschließender Reoxygenierung konnte überprüft werden, ob Dupuytrenfibroblasten im Vergleich zu normalen humanen dermalen Fibroblasten ein spezifisches Muster bzgl. der o. g. Parameter zeigen. Nach der initialen Erzeugung eines Wundspalts wurde die Zellmigration durch die Vermessung des Spaltschlusses im zeitlichen Verlauf ermittelt. Sowohl die Proliferationsrate als auch die Myofibroblasten-Differenzierungsrate konnten mit Hilfe von Immunfärbungen bestimmt werden und die Unterscheidung von Endothelzellen und Fibroblasten in Co-Kultur erfolgen. Die Apoptoserate wurde mikroskopisch anhand der Ausbildung von Mikronuklei quantifiziert und zusätzlich die Rate frühapoptotischer Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Menge von Platelet-Derived Growth Factor AA in den Zellkulturüberständen wurde mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay ermittelt und die Freisetzung weiterer Zytokine mit einem Multiplex Immunoassay bestimmt. Dupuytrenfibroblasten und normale humane dermale Fibroblasten zeigten bei Mono- und Co-Kultivierung einen ähnlichen Spaltschluss im zeitlichen Verlauf, mit einer signifikanten Hemmung der Migration in den Hypoxie-Kulturen gegenüber den Normoxie-Kulturen. Die Proliferationsrate (Ki-67/MIB-1) der Dupuytrenfibroblasten in Mono- und Co-Kultur war gegenüber den normalen humanen dermalen Fibroblasten stets tendenziell erniedrigt. Hypoxie führte in allen Kulturen zu einer signifikanten Abnahme der Proliferation im Vergleich zur Normoxie, mit der tendenziell niedrigsten Proliferationsrate in den Co-Kulturen von Dupuytrenfibroblasten. Die anschließende Reoxygenierung bewirkte einen signifikanten Anstieg der Proliferation in allen Kulturen. Ausschließlich in den Co-Kulturen von Dupuytrenfibroblasten mit Endothelzellen war die Myofibroblasten-Differenzierungsrate stabil. Sowohl in den Mono-Kulturen als auch den Co-Kulturen von normalen humanen dermalen Fibroblasten fiel die Myofibroblasten-Differenzierungsrate im zeitlichen Verlauf tendenziell ab. Die Apoptoserate der Dupuytrenfibroblasten und der normalen humanen dermalen Fibroblasten lag an den Tagen 0, 1 und 2 unter Normoxie bei weniger als 0,5%. Nach Hypoxie kam es in allen Zellkulturen zu einem signifikanten Anstieg der Apoptoserate im Vergleich zur Normoxie, mit der geringsten Rate in den Co-Kulturen von Dupuytrenfibroblasten (4%). Dupuytrenfibroblasten und normale humane dermale Fibroblasten in Mono-Kultur setzten keinen Platelet-Derived Growth Factor AA frei. Bei Co-Kultivierung von Dupuytrenfibroblasten mit Endothelzellen kam es im Gegensatz zu den Co-Kulturen mit normalen humanen dermalen Fibroblasten zu einem tendenziellen Anstieg der Platelet-Derived Growth Factor AA-Konzentration in den Zellkulturüberständen im zeitlichen Verlauf, mit tendenziell erhöhten Konzentrationen in den Hypoxie-Kulturen gegenüber den Normoxie-Kulturen. Dupuytrenfibroblasten in Mono-Kultur setzten nach 24 h Normoxie insgesamt 21 unterschiedliche Zytokine frei. Es zeigte sich der Trend, dass Dupuytrenfibroblasten im Mittel Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (9,26 fg/Zelle), Interleukin-6 (7,48 fg/Zelle) und Vascular Endothelial Growth Factor (6,86 fg/Zelle) am stärksten freisetzten. Mit dem verwendeten In-vitro-Modell konnten Dupuytrenfibroblasten bzw. normale humane dermale Fibroblasten zusammen mit Endothelzellen kultiviert werden. Es konnten Unterschiede und Gemeinsamkeiten der verschiedenen Zelltypen in Bezug auf Migration, Proliferation, myofibroblastoide Differenzierung, Apoptose und Zytokinfreisetzung aufgezeigt werden. Die wechselseitigen Effekte bei Co-Kultivierung der Dupuytrenfibroblasten bzw. normalen humanen dermalen Fibroblasten mit Endothelzellen sowie der Einfluss der Hypoxie bzw. anschließenden Reoxygenierung auf die ausgewählten Parameter konnte dargestellt werden. Das Co-Kultur-Wounding-Modell könnte daher in zukünftigen Studien unter Einbeziehung weiterer Parameter und einer größeren Fallzahl verwendet werden, um prognostische Marker zu etablieren, welche zuverlässige Rückschlüsse auf die Zellaktivität und die damit verbundene Krankheitsprogression beim Morbus Dupuytren erlauben.

Dupuytren’s disease is a palmar fibromatosis which leads to flexion deformity of the fingers. The origin of the flexion contracture is caused by multiple impacts and depends on genetic predilection factors, the existence of internistic diseases and environmental influences. The mutual influence of fibroblasts from patients with Dupuytren’s disease (Dupuytren's fibroblasts) and endothelial cells by both, direct cell-cell interaction and cytokine regulation, is discussed to play a key role in the development of Dupuytren’s disease. High occurrence of myofibroblasts which are found in the palmar fascial tissue is a pathognomonic sign. Contractile forces by the cytoskeleton of myofibroblasts lead to typical contractures of one or more fingers. Patients suffering from Dupuytren’s contracture were treated by limited fasciectomy and Dupuytren's fibroblasts were isolated and cultured to create mono-cultures and co-cultures with human dermal microvascular endothelial cells. A co-culture wound model was used in the current study which was considered to be an effective tool to verify different characteristics of Dupuytren's fibroblasts compared to normal human dermal fibroblasts by the parameters migration, proliferation, myofibroblastoid differentiation, apoptosis, platelet-derived growth factor AA and cytokine release under normoxic and hypoxic conditions. It was possible to demonstrate that Dupuytren's fibroblasts present a specific pattern of the used parameters compared to normal human dermal fibroblasts by fixing the cells on day 0, after 24 h of normoxia or hypoxia and after 48 h of normoxia or hypoxia and subsequent reoxygenation. After initially inducing a scratch wound, cell migration was analysed by measuring the scratch wound closure over time. Using immunocytochemical stainings we were able to determine proliferation rate as well as myofibroblast differentiation rate and identifying endothelial cells in co-culture with fibroblasts. The rate of apoptosis was quantified by the appearance of micronuclei using microscopy and early phase of apoptosis was additionally determined by flow cytometry. An enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the amount of platelet-derived growth factor AA in the cell culture supernatants and a multiplex immunoassay was applied in order to characterise the cytokine release. Wound closure in mono- and co-cultures of Dupuytren's fibroblasts and normal human dermal fibroblasts was similar over time. There was a significant inhibition of migration in hypoxic cultures compared to normoxic cultures. Dupuytren's fibroblasts in mono- and co-culture showed a generally decreased proliferation rate (Ki-67/MIB-1) compared to normal human dermal fibroblasts. In all cultures hypoxia led to a significant inhibition of proliferation compared to normoxic conditions and the lowest proliferation rate by trend was detected in co-cultures of Dupuytren's fibroblasts. Subsequent reoxygenation caused a significant increase of proliferation in all cultures. Only for co-cultures of Dupuytren's fibroblasts with endothelial cells the myofibroblast differentiation rate seemed to be stable. Throughout the cultivation period normal human dermal fibroblasts revealed a tending decrease of myofibroblast differentiation rate, both in mono- and co-cultures. The rate of apoptosis of Dupuytren's fibroblasts and normal human dermal fibroblasts was at test day 0, 1 and 2 under normoxia below 0.5%. The rate of apoptosis was significantly increased in all cell cultures after hypoxia compared to normoxia and the lowest number of apoptotic cells was detected in co-cultures of Dupuytren's fibroblasts (4%). Dupuytren's fibroblasts and normal human dermal fibroblasts in mono-culture did not release platelet-derived growth factor AA. In contrast to co-cultures of normal human dermal fibroblasts, there was a tending increase of platelet-derived growth factor AA-concentration in cell culture supernatants of co-cultures of Dupuytren's fibroblasts together with endothelial cells over time and concentration detected in hypoxic cultures was increased by trend compared to normoxic cultures. After 24 h of normoxia Dupuytren's fibroblasts in mono-culture released 21 different cytokines in total. In general, the tendency shows, that Dupuytren's fibroblasts released mostly granulocyte macrophage-colony stimulating factor (9.26 fg/cell), interleukin-6 (7.48 fg/cell) and vascular endothelial growth factor (6.86 fg/cell). The in vitro model established in this study allows for co-culture of Dupuytren's fibroblasts and normal human dermal fibroblasts with endothelial cells. It has been revealed that there are different and common features of the different cell types referring to migration, proliferation, myofibroblastoid differentiation, apoptosis and cytokine release. Alternating effects of co-culturing Dupuytren's fibroblasts and normal human dermal fibroblasts together with endothelial cells as well as the influence of hypoxia and subsequent reoxygenation on the chosen parameters were demonstrated. The co-culture wound model therefore could be used in future studies by taking additional parameters and a higher case number into account to establish prognostic markers which allow reliable conclusions on cell activity and related Dupuytren’s disease progression.