Die AMP-Kinase als zentraler Mediator in der Verhinderung Fettsäure-induzierter Apoptose und Lipidakkumulation in Kardiomyozyten

Abstract

Die AMP-Kinase als zentraler Mediator in der Verhinderung Fettsäure-induzierter Apoptose und Lipidakkumulation in Kardiomyozyten Palmitinsäure ist die am stärksten vertretene Fettsäure in unserer Nahrung und kann zytotoxische und apoptotische Effekte induzieren, wobei der Mechanismus noch weitgehend unklar ist [1]. Riquelme et al. beschrieben die myokardiale Wirkung einer spezifischen Kombination der Fettsäuren Palmitin-, Myristin- und Palmitoleinsäure (später als FS-Mix bezeichnet) im molaren Verhältnis von 16:6:1. [2; Science, 2011]. Diese Fettsäurekombination war in Schlangen (Pythons) nach einer großen Mahlzeit für eine physiologische kardiomyozytäre Hypertrophie verantwortlich und führte auch in Mäusen zu kardialer Hypertrophie [2]. Das Ziel dieser Arbeit war, den zugrunde liegenden Mechanismus weiter zu charakterisieren. Der FS-Mix wurde über subkutane ALZET® mini-osmotische Pumpen über einen Zeitraum von 7 Tagen bei C57/Bl6 Mäusen infundiert. In einem zweiten Versuch wurden die Fettsäuren mittels subkutaner Spritzeninjektion über 5 Wochen zugeführt. Entgegen der Studienhypothesen wurde nach Behandlung der Mäuse mit dem FS-Mix keine Hypertrophie oder signifikante Veränderungen hämodynamischer Parameter beobachtet. In weiteren Versuchsreihen wurden neonatale ventrikuläre Ratten-Kardiomyozyten mit dem FS-Mix oder mit Palmitinsäure behandelt. Durchflusszytometrische Analysen mittels Annexin V und Propidium Iodid zeigten eine auf 158±3% gesteigerte Apoptose in den mit Palmitinsäure, nicht jedoch in den mit dem FS-Mix behandelten Kardiomyozyten. Die Behandlung mit dem FS-Mix führte im Gegensatz zur Behandlung mit Palmitinsäure zu einer auf 155±19% gesteigerten Phosphorylierung der AMP aktivierten Proteinkinase (AMPK). Die AMPK ist eine ubiquitär exprimierte Proteinkinase und ein zentraler Regulator des zellulären Energiemetabolismus [3]. Die AMPK ist in der Lage, die Fettsäureoxidation unabhängig von der Fettsäureaufnahme zu steigern [4]. Die Phosphorylierung des AMPK-Target Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), dem Hauptregulator der Fettsäureoxidation, war in den mit dem FS-Mix behandelten Kardiomyozyten auf 177±23% gesteigert. Die Behandlung mit Palmitinsäure führte nicht zu einer Aktivierung von AMPK und ACC, jedoch zu einer auf 163±23% gesteigerten Expression der Fettsäuretranslokase CD36 (FAT/CD36), welche für die Aufnahme von 50-70% der Fettsäuren im Herzen verantwortlich ist [5]. Die Expression von FAT/CD36 wurde durch den FS-Mix nicht beeinflusst. Da Palmitinsäure zu einer potentiell lipotoxischen Konstellation von gesteigerter Fettsäureaufnahme bei gleichbleibender Fettsäureoxidation führte, wurde auch ADRP (adipose differentiation-related protein), ein sensitiver Marker für Lipidakkumulation, untersucht [6]. ADRP wurde lediglich in den mit Palmitinsäure behandelten Zellen mit 168±42% vermehrt exprimiert. Dies war mit einer auf 172±22% bzw. 173±27% gesteigerten Phosphorylierung der Stress-aktivierten Proteinkinase/Jun-amino-terminal-kinase (SAPK/JNK) an Thr183 bzw. Tyr185 assoziiert. In mit dem FS-Mix behandelten Zellen blieb die Phosphorylierung der SAPK/JNK unverändert. Präinkubation mit dem AMPK-Aktivator AICAR steigerte die AMPK- und ACC-Phosphorylierung in mit Palmitinsäure behandelten Zellen auf 170±30% bzw. 242±33%. Zudem verhinderte die Präinkubation mit AICAR eine Hochregulierung von ADRP und eine gesteigerte Apoptose in Kardiomyozyten, die mit Palmitinsäure behandelt wurden. In Einklang mit diesen Beobachtungen führte eine Inhibition der AMPK durch Compound C in Kardiomyozyten, die mit dem FS-Mix behandelt wurden, zu einer Steigerung der ADRP-Expression auf 154±27% und einer Steigerung der Apoptose auf 183±12%. Alle Ergebnisse waren signifikant mit p<0,05. Zusammenfassend führte Palmitinsäure in Kardiomyozyten zu Lipidakkumulation und gesteigerter Apoptose. Die Kombination von Palmitinsäure mit Myristin- und Palitoleinsäure (FS-Mix) führte zu gesteigerter Phosphorylierung der AMPK und verhinderte Palmitinsäure-induzierte Lipidakkumulation und Apoptose. Die Ergebnisse dieser Arbeit indentifizieren die AMPK als einen wichtigen Mediator in der Verhinderung von Fettsäure-induzierter Apoptose in Kardiomyozyten.

Palmitic acid is the main fatty acid occurring naturally in human nutrition and is known to induce cytotoxic and apoptotic effects in cardiomyocytes, however the underlying mechanisms are incompletely understood [1]. Riquelme et al. described the myocardial effect of a specific combination of the fatty acids palmitic, myristic and palmitoleic acid (later called FS-Mix) in a molar ratio of 16:6:1 [2; Science, 2011]. This fatty acid combination was described to cause a physiological hypertrophy of cardiomyocytes in snakes (pythons) after a big meal and was also found to cause cardiac hypertrophy in mice [2]. The aim of this study was to characterize the underlying mechanism. The FS-Mix was applied by subcutaneous ALZET® mini-osmotic pumps for 7 days in C57/Bl6 mice. In a second experiment fatty acids were applied by subcutaneous injection over 5 weeks. Contrary to the study hypothesis hypertrophy or significant changes of hemodynamic parameters were not observed after treatment with the FS-Mix. In further experiments neonatal rat ventricular cardiomyocytes were treated with the FS-Mix or palmitic acid. Flow cytometry using annexin V and propidium iodide revealed an increase of apoptosis to 158±3% in cardiomyocytes treated with palmitic acid but not FS-Mix compared to untreated cells. Treatment with FS-Mix but not palmitic acid resulted in increased phosphorylation of AMP activated protein kinase (APMK) to 155±19%. AMPK is an ubiquitary expressed kinase regulating cellular energy metabolism [3]. AMPK is able to mediate up-regulation of fatty acid oxidation independent of fatty acid uptake [4]. Consequently, the phosphorylation of the AMPK target Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), that is a main regulator of fatty acid oxidation, was increased to 177±23% in FS-Mix treated cardiomyocytes. Treatment of cardiomyocytes with palmitic acid failed to activate AMPK and ACC, but resulted in increased expression of fatty acid translocase CD36 (FAT/CD36) to 163±23% which is responsible for 50-70% of fatty acid uptake in the heart [5]. FAT/CD36 expression in cardiomyocytes treated with FS-Mix was unaffected. Since palmitic acid treatment induced a potentially lipotoxic constellation of elevated fatty acid uptake without increasing fatty acid oxidation, adipose differentiation-related protein (ADRP), a sensitive marker for cytosolic lipid accumulation, was assessed [6]. Expression of ADRP was increased to 168±42% only in palmitic acid treated cells. This was associated with an increased phosphorylation of the stress-activated protein kinase/Jun-amino-terminal-kinase (SAPK/JNK) at Thr183 and Tyr185 to 172±22% and 173±27%, respectively. In FS-Mix treated cells, phosphorylation of SAPK/JNK was unaltered. Preincubation with the AMPK activator AICAR increased AMPK and ACC phosphorylation in palmitic acid treated cells to 170±30% and 242±33% respectively. In addition, pre-incubation with AICAR prevented up-regulation of ADRP and increased apoptosis in cardiomyocytes treated with palmitic acid. Confirming these findings, inhibition of AMPK by Compound C in FS-Mix treated cardiomyocytes resulted in increased ADRP expression to 154±27% and increased apoptosis to 183±12%. All effects were significant with p<0.05. In summary, treatment of cardiomyocytes with palmitic acid induced lipid accumulation resulting in increased apoptosis. Treatment with palmitic acid in combination with myristic and palmitoleic acid (FS-Mix) increased phosphorylation of AMPK and prevented palmitic acid induced lipid accumulation and apoptosis. The data identify AMPK as an important mediator in prevention of fatty acid induced apoptosis in cardiomyocytes.