Transistor-Transferfunktionsmessungen mittels ionensensitiven Feldeffekt-Transistoren zur Ermittlung der Zellviabilität als neue Möglichkeit des pharmakologischen Hochdurchsatzscreenings : Transistor-Transfer function measurements using ionensensitive field-effect transistors to analyze cell viability as a novel tool for pharmacological high throughput screening

Abstract

Cancer is one of the most common cause of death and one of the most severe diagnoses patients can receive in modern medicine. Its treatment normally involves a combination of chemotherapy, tumor resection and radiation therapy, often accompanied by severe side effects causing high psychological strain. In recent years treatment shifts from general approaches to individual therapy regiments for individual patients. A similar situation can be assumed for neurodegenerative diseases like Alzheimer’s or Parkinson’s disease, for which oxidative stress is a common contributing factor. For both cancer and neurodegenerative diseases the development of new pharmacological compounds and treatment strategies is a high priority goal facilitating the need for fast and efficient screening and testing platforms. The objective of this thesis was the establishment of an impedance spectroscopy-based high throughput testing system using silicon-based field-effect transistors. During this thesis work three subprojects were conducted. The first subproject of this thesis covered the topic of the analysis of cellular adhesion. Morphologically and histologically different cell lines were compared with regard to their respective impedance spectra (for both confluent and low density cultures) and unique characteristics of the tested cell lines were identified, demonstrating the ability of the presented system to differentiate between cells of different cell types down to the single cell level. In the second subproject the toxicity of an industrial silica nanoparticle was monitored in real time under cell culture conditions using the presented FETCIS system. Observed transfer-function suppression between 30 and 60 min after particle administration could be correlated with the observed cytotoxic effect of the used particle NexSil20. By analyzing the toxicity of an already described particle via real-time impedance monitoring, the applicability of the proposed system was further substantiated. During the third subproject of this thesis work the applicability of the presented system to simultaneously monitor the reaction of primary neuronal tissue to external stimuli using a parallel-culture setup. Primary SVZ cells were exposed to hydrogen peroxide to induce apoptosis and monitored for their response to this treatment. By analyzing the effects of hydrogen peroxide toxicity in neuronal tissues the capability to open up new research applications in Alzheimer’s and Parkinson’s disease of the presented system could be shown. The measurement and analysis system presented in this thesis work is primarily meant for pharmacological testing both in real time and under cell culture conditions, providing a fast working method of analyzing the effects of external stimuli like pharmacological compounds or effects of micro-environmental conditions (e.g. temperature, pH value, etc.). As a second possible application the presented system should also be usable in the field of individualized cancer diagnostics and therapy. By differentiating between the impedimetric fingerprints of different cell types an impedimetric histology system would be possible.

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen und gleichzeitig eine der erschütterndsten Diagnosen der modernen Medizin, die Patienten erhalten können. Die Behandlung besteht normallerweise aus Chemotherapie, Tumorresektion und Strahlentherapie zusammen, wobei die Behandlung häufig mit starken Nebenwirkungen und einem hohen Leidensdruck verbunden ist. In den letzten Jahren verlagert sich die Behandlung von Krebs weg von generischen Behandlungsansätzen hin zur individuell auf einzelne Patienten zugeschnittenen Therapie. Eine ähnliche Entwicklung lässt sich bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson erkennen, bei denen oxidativer Stress als gemeinsamer begünstigender Faktor eine Rolle spielt. Sowohl für Krebs als auch neurodegenerative Erkrankungen ist die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Behandlungsansätze ein Ziel mit hoher Priorität, was die Etablierung von schnellen und effizienten Screening-Plattformen nötig macht. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung einer auf Impedanzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Plattform, die siliziumbasierte Feldeffekt-Transistoren verwendet. Im Verlauf dieser Arbeit wurden drei Unterprojekte bearbeitet. Im Verlauf des ersten Unterprojekts wurde die Zelladhäsion dreier morphologisch und histologisch unterschiedlicher Zelltypen untersucht und bezüglich ihrer jeweiligen Impedanzspektren verglichen (sowohl für konfluente als auch nicht-konfluente Zellkulturen). Dabei wurden für die verschieden Zelltypen charakteristische Merkmale beobachtet, die die Fähigkeit des vorgestellten Systems zur Unterscheidung spezifischer Zelltypen voneinander mit einer Auflösung bis zur Einzelzellebene belegt. Im Zuge des zweiten Unterprojekts wurde die Toxizität eines industriellen Silica-Nanopartikels in Echtzeit unter Zellkulturbedingungen mittels des präsentierten FETCIS-Systems untersucht. Dabei konnte eine Unterdrückung der Transistor-Transferfunktion zwischen 30 und 60 min nach Partikelapplikation beobachtet werden, die mit bereits veröffentlichten Toxizitätsergebnissen des verwendeten Partikels NexSil20 korrelieren. Durch die Analyse der Zytotoxizität eines bereits beschriebenen Partikels via Echtzeit-Impedanzmessung konnte die Anwendbarkeit der beschriebenen Methode in pharmakologischen Studien weiter belegt werden. Das dritte Unterprojekt der vorliegenden Arbeit diente dem Beleg der Nutzbarkeit des vorgestellten Systems zur simultanen Untersuchung der Reaktion primären neuronalen Gewebes auf externe Stimuli mittels eines Parallel-Kultur-Setups. Primäre SVZ-Zellen wurden mit Wasserstoffperoxid behandelt um Apoptose zu induzieren, anschließend wurde die Reaktion der Zellen auf diese Behandlung beobachtet. Durch die Analyse der Wasserstoffperoxid-Toxizität in neuronalem Gewebe konnte die Fähigkeit des vorgestellten Systems gezeigt werden neue Forschungsanwendungen in den Bereichen Alzheimer und Parkinson zu eröffnen. Das in dieser Arbeit vorgestellte Mess- und Analysesystem soll primär für pharmakologische Untersuchungen in Echtzeit und unter Zellkulturbedingungen verwendet werden und stellt dabei eine schnelle Methode dar die Effekte externer Stimuli, wie pharmakologische Wirkstoffe oder Veränderungen der Umgebungsbedingungen (z.B. Temperatur, pH-Wert, etc.) zu untersuchen. Eine zweite mögliche Anwendung des vorgestellten Systems liegt im Feld der individualisierten Krebsdiagnostik und –therapie. Durch die Unterscheidung der impedimetrischen Fingerabdrücke unterschiedlicher Zelltypen ist eine impedimetrische Histologie möglich.