Cytotoxic Granule Endocytosis in Primary Mouse Cytotoxic T Lymphocytes

Abstract

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) fight against infection by eliminating virus-infected and malignant cells from the body. CTLs recognize its target upon specific T cell receptor engagement and consequently triggers cytotoxic granules (CGs) release to the cell-cell contact site, termed immunological synapse (IS) to induce target cell death. CTLs are efficient killers as multiple routes of fast lethal deliveries suggest, however whether the sustained cytotoxic supply from retrieved granules after fusion contributes to multiple target cell killing remains unknown. By using primary CTLs isolated from Synaptobrevin2-mRFP knock-in mice, we demonstrate endocytosis of the specific CG membrane protein Syb2 at the IS upon target cell contact by confocal live cell imaging. CG endocytosis is Clathrin- and Dynamin-dependent, and later on endocytosed CGs became re-filled with toxic substances like Granzyme B to again enable cytotoxicity. These endocytic granules polarized to respective synapses upon sequential target cell contacts. Importantly, blocking CG endocytosis reduces the serial killing efficiency by about 50%, indicating endocytic CGs contribute significantly to the overall cytotoxic capacity. These data demonstrate that continuous endocytosis of CG membrane proteins is a prerequisite for efficient serial killing of CTLs and identify key events in this process. We further investigate the involvement of the vesicular membrane protein Flower in the calcium-dependence of CG endocytosis. It was previously suggested to function as a calcium channel to regulate synaptic endocytosis in drosophila. Flower is proposed to transfer from vesicle to plasma membrane through vesicle fusion and thus regulates calcium influx. We showed that the Flower protein, which contains four transmembrane domains, is expressed in mouse CTLs. Flower-deficiency does not affect degranulation or CG exocytosis, however, it leads to a block of CG endocytosis at an early stage. This defect in endocytosis can be rescued by re-introducing Flower or by increasing extracellular calcium, suggesting that the phenotype is specifically due to a lack of Flower and that other calcium sources could compensate its function. Additionally, Flower vesicles polarize early to the IS and localize around exocytic and endocytic granules. Intriguingly, a Flower mutant with tyrosin motifs (YxxF) substituted to alanine shows a re-distribution from vesicles to the plasma membrane, but fails to rescue the endocytosis defect. This result implies that either Flower functions on vesicles rather than at the plasma membrane or that active Flower requires interaction with other molecules via its tyrosin motifs. Taken together, these data identify Flower as an essential molecule initiating granule endocytosis. However, further studies are required to answer the question whether Flower plays a role in calcium-dependence of endocytosis.

Zytotoxische T Lymphozyten (CTLs) bekämpfen Infektionen, indem sie virusinfizierte oder entartete Zellen eliminieren. CTLs identifizieren ihre Zielzellen mit Hilfe spezifischer T-Zell Rezeptoren, was zur Ausbildung eines Zell-Zell-Kontaktes, der sogenannten Immunologischen Synapse, führt. An dieser IS erfolgt letztlich die Fusion zytotoxischer Granula (CGs), die den Zelltod der Zielzelle induzieren. CTLs sind effektive Tötungsmaschinen, da sie hintereinander Tausende an Zielzellen in kurzer Zeit eliminieren können. Allerdings ist unklar, inwieweit an dieser seriellen Zytotoxizität rezyklierte Granula beteiligt sind. Durch die Nutzung von CTLs, die aus Synaptobrevin2-mRFP Knock-in Mäusen gewonnen wurden, konnten wir mit Hilfe konfokaler Mikroskopie zeigen, dass Syb2 an der IS nach Zielzellkontakt endozytiert wird. Die Endozytose von CGs erfolgt über Clathrin- und Dynamin-abhängige Wege. Später werden endozytierte CGs mit toxischen Substanzen wie GranzymeB aufgefüllt, um die Zytotoxizität erneut herzustellen. Diese endozytotischen Granula polarisieren dann zu den jeweiligen Synapsen neuer Zielzellkontakte. Wichtiger Weise führt die Blockierung der Endozytose zu einer etwa um 50% reduzierten Tötungseffizienz, was ein Hinweis darauf ist, dass Endozytose zur zytotoxischen Gesamtkapazität signifikant beiträgt. Diese Daten zeigen, dass die Endozytose von CG Membranproteinen eine Voraussetzung für effizientes serielles Abtöten von Zielzellen durch CTLs ist und identifizieren Schlüsselereignisse dieses Prozesses. Weiterhin untersuchten wir ein Kandidatenmolekül für die Kalziumabhängigkeit der CG Endozytose. Dieses Flower genannte, vesikuläre Protein könnte in Drosophila melanogaster ein endozytoseregulierender Kalziumkanal sein. Es wird angenommen, dass Flower durch Fusion vom Vesikeln zur Plasmamembran transferiert wird und dort den Kalziumeinstrom reguliert. Wir konnten die Expression des Flower-Proteins, welches vier Transmembrandomänen enthält, in CTLs der Maus nachweisen. Das Fehlen des Flower-Proteins beeinflusste weder die Degranulation noch die Exozytose der CGs, führte aber zu einem vollständigen Block der CG Endozytose in einem frühen Stadium. Dieser Endozytose-Defekt konnte durch erneutes Hinzufügen von Flower oder durch eine Erhöhung der extrazellulären Kalziumkonzentration behoben werden. Es kann also angenommen werden, dass der Defekt spezifisch für das Fehlen von Flower war und andere Kalziumquellen das Fehlen von Flower kompensieren können. Hinzu kommt, dass Flower Vesikel früh zur IS polarisieren und in der Nähe exo- und endozytotischer Vesikel zu finden sind. Interessanter Weise zeigen Flower Mutanten, bei denen bestimmte Tyrosine zu Alanin ausgetauscht wurden, eine Neuverteilung von Flower von Vesikeln hin zur Plasmamembran, ohne jedoch den Endozytose-Defekt zu beheben. Diese Ergebnisse können in zweierlei Weise interpretiert werden: der Ort des Flower- Effekts ist eher das Vesikel als die Plasmamembran oder aktives Flower benötigt Interaktionen mit anderen Molekülen über seine Tyrosin Motive. Diese Daten legen nahe, dass Flower ein essentielles Molekül für die Auslösung der Endozytose ist. Allerdings sind für die Klärung der Frage, ob Flower eine Rolle in der Kalziumabhängigkeit spielt, weitere Experimente in zukünftigen Untersuchungen notwendig.