Evolution wachsender, sich reproduzierender Polymere : Zellfreie Genexpression zum Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren in Proteine sowie zur Analyse des epigenetischen Escherichia-coli-Pili-Phasenvariationsmechanismus.

Abstract

Seit Beginn des Lebens entstehen durch Reproduktion, Variation und Selektion immer neue Spezies. Stetige Erneuerung statt Stagnation ist Teil der Evolution. Ein Modellsystem aus linearen DNA-Molekülen wurde entwickelt, in dem durch spontane Ligation neue Polymere entstehen, die sich Template-basiert vermehren. Bei adäquat hohen Reproduktionsraten wurden unter den länger werdenden Polymeren gewisse Längen selektiert. Dieser stetige, selektive Innovationsprozess zeigt gewisse Parallelen zur biologischen Evolution. Der Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren kann natürliche Proteinfunktionen erweitern. Nicht-kanonische Aminosäuren-Analoga hemmen oft das Expressionswirts-Wachstum, limitieren so den in-vivo-Ansatz. Besonders der in-vivo-Einbau toxischer Analoga wie L-Canavanin ist schwierig. Jedoch konnte gezeigt werden, dass ein zellfreies Escherichia-coli-Expressionssystem dieses medizinisch relevante Analogon vollständig einbaut, ein neuer Ansatz, modifizierte Proteine für Folgestudien herzustellen. Weitere nicht-kanonische Aminosäuren wurden auch, jedoch weniger effizient, eingebaut. Die Regulation des epigenetischen Escherichia-coli-Pili-Phasenvariationsmechanismus erfolgt transkriptionell durch Modulation des DNA-Methylierungsmusters, involviert Koregulatoren. Es wurde eine synthetische regulatorische DNA im obigen Expressionssystem studiert und theoretisch analysiert. Die DNA wechselwirkte methylierungsabhängig mit sich selbst. Folglich wurde der Mechanismus neu interpretiert.

Since the origin of life the emergence of new species has been promoted by reproduction, variation, and selection. Instead of stalling, Evolution innovates ad infinitum. A model system of linear DNA molecules was devised where new template-based proliferating polymers appear by spontaneous ligation. While length increasing polymers were emerging, for sufficiently high reproduction rates particular lengths were constantly being selected. This steady, selective innovation process bears resemblance to biological evolution. The incorporation of noncanonical amino acids can extend natural protein functionalities. The in vivo approach is limited as non-canonical amino acid analogues often act as growth inhibitors for expression hosts. In vivo incorporation of toxic analogues like L-canavanine is exceptionally difficult. However, it was shown that an Escherichia coli cell-free expression system completely incorporates this medically relevant analogue into a model protein, a new approach producing modified proteins for further studies. Other noncanonical amino acids were incorporated, albeit with lower efficiency. The regulation of the epigenetic Escherichia coli pili phase variation mechanism transcriptionally proceeds by DNA methylation pattern modulation, involving coregulators. A synthetic regulatory DNA was studied in the above expression system and theoretically analyzed. Dependent on the methylation pattern, this DNA self-interacted. Accordingly, the mechanism was reinterpreted.