Virtual reaction chambers as a tool for DNA sequencing

Abstract

The topic of this thesis refers to the contribution of genetic variations, in which single nucleotide polymorphisms (SNP) can be included, to the manifestation and cause of disease. The facilitation of the treatment and cure of such conditions is done through identification and study of the cascade of biological mechanisms and processes; however the achievement of such goals is hampered by the formidable complexity and scale of the data sets involved in nucleic acid and protein analysis and thus the development of faster and cheaper methods is desirable. An intuitive trajectory for this development is the miniaturization of analytical methods with the incorporation of microfluidics which entails the manipulation of fluid analytes through channels and chambers on the microscale. This young field is projected to be instrumental in the realization of low temporal and financial cost analytical techniques. This thesis demonstrates the application of open-surface microfluidics to sequence DNA with the use of pyrosequencing. This method facilitates a reduction in instrument complexity and size and thus allows for functional integration or device disposability. Following incubation of the DNA with superparamagnetic particles, it was placed on a hydrophobic glass substrate. The DNA was then moved through microliter-volumes of mineral oil-coated water droplets via manipulation of the nanoparticles using a magnetic field; thus, these droplets could then be used either for pyrosequencing or for washing of the DNA strands. The reaction performance was determined, using the resequencing protocol with a 34 base pair (bps) of single-stranded DNA, to be highly linear for all 4 homopolymers events tested. De novo sequencing was performed with 51 and 81 bps while it was also verified that up to 7 homopolymers could be determined. This method displays full compatibility with previously demonstrated open surface steps for sample preparation and so confirms PCR on a flat glass substrate as an integrated sample-to-answer protocol. All assays were based on primer extension via DNA polymerase. A microfluidic device consisting of microliter-volume droplet-to-droplet DNA transport via manipulation of magnetic particles was used in this work. The VI difference in reaction kinetics for matched and mismatched configurations at the 3’-ends of the primer-template complex was employed in sample differentiation. The assay combined pyrosequencing technology with a sequence-by-synthesis bioluminometric DNA sequencing probe on one common microfluidic platform. Base-by-base sequencing was performed to obtain accurate single nucleotide polymorphism (SNP) scoring data with microliter volumes. The application of magnetically actuated beads to facilitate virtual chamber reactions for chip based DNA analysis was presented. Single base incorporation was seen to be detectable with the use of this pyrosequencing assay.

Mit Abschluss des Humangenomprojekts verlagert sich der Fokus darauf, zu verstehen, wie genetische Variationen, wie z. B. Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP, single nucleotide polymorphism), zu Erkrankungen führen. Die enorme Menge an Sequenzinformationen müssen mit schnelleren, wirtschaftlicheren und leistungsfähigeren Technologien für die Analyse von RNA, DNA und Proteinen analysiert werden, um die die biologischen Mechanismen lebender Organismen zu verstehen und zu kontrollieren. Ein Ansatz ist die Miniaturisierung analytischer Methoden durch die Anwendung der Mikrofluidik, wobei Ströme in Kanälen auf der Mikrometer-Skala manipuliert werden. Es wird erwartet, dass Fortschritte in der Mikrofluidik-Chip-Technologie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung wirtschaftlicher und schneller DNA-Analysemethoden spielen werden. In dieser Doktorarbeit wird die Anwendung von Mikrofluidik an offenen Oberfläche für die Sequenzierung von DNA mittels Pyrosequenzierung demonstriert. Dies bietet Vorteile bezüglich der Instrumentengröße, der Einfachheit, Verfügbarkeit und Funktionsintegration, insbesondere in Kombination mit den vielfältigen und flexiblen Möglichkeiten der Mikrofluidik an offenen Oberflächen. Die DNA wurde auf superparamagnetischen Partikeln inkubiert und auf ein Glassubstrat mit hydrophobischer Schicht platziert. Die Partikel mit gebundener DNA wurden mithilfe von Magnetkraft über Tropfen in Mikroliter-Größe, beschichtet mit Mineralöl zur Verhinderung von Verdunstung, bewegt. Diese Tropfen dienten als Reaktionsstationen für die Pyrosequenzierung sowie als Waschstationen. Das Sequenzierungsprotokoll mit 34 Basenpaaren (bps) einzelsträngiger DNA wurde zur Bestimmung der Reaktionsleistung verwendet und zeigte eine ausgezeichnete Linearität für alle 4 Homopolymere. Diese De-novo-Sequenzierung wurde mit 51 und 81 bps durchgeführt. Wir haben außerdem geprüft, dass bis zu 7 Homopolymere bestimmt werden können. Dieses Verfahren ist vollständig mit bisher verwendeten Schritten zur Probenvorbereitung an offenen Oberflächen kompatibel. Daher kann eine PCR als vollständig integriertes System von der VIII Probe bis zum Ergebnis auf einem flachen Glassubstrat zusammengestellt werden. In dieser Doktorarbeit werden Mikrofluidik-Anwendungen für verschiedene Genotypisierungsassay vorgestellt. Das übergeordnete Ziel ist die Kombination des Potentials des Chiplabor-Konzepts der Mikrofluidik mit Biochemie, um Verfahren für die DNA-Analyse zu entwickeln uns derzeit verfügbare Verfahren zu verbessern. Drei Genotypisierungsassays werden hier mithilfe von miniaturisierten Mikrofluidik-Methoden überprüft. Alle Assays basieren auf der Verlängerung von Primeren durch DNA-Polymerase. Ein Mikrofluidik-Instrument mit Handhabung von Tropfen zu Tropfen für Magnetpartikel für Volumen im Mikroliterbereich wurde in diesen Studien verwendet. Das Mikrofluidik-Verfahren nutzt die Vorteile der unterschiedlichen Reaktionskinetik für komplementäre und nicht-komplementäre Konfigurationen am 3‘-Ende des Primer-Template-Komplexes. Insgesamt beinhalteten die Assays die Anpassung der Pyrosequenzierungstechnologie, eines bioluminometrischen DNA-Sequenzierungsassays basierend auf Sequenzierung durch Synthese, an dieselbe Mikrofluidik-Plattform. Basenweise Sequenzierung wurde in einem Mikrofluidik-Instrument durchgeführt, um genaue SNP-Scoring-Daten für Volumina im Mikroliterbereich zu erzielen. In dieser Doktorarbeit wird die Anwendung virtueller Reaktionskammern von Partikel, die magnetisch ausgelöst werden, für die Chip-basierte DNA-Analyse präsentiert. Die Inkorporation von einzelnen Basen mithilfe der Pyrosequenzierungsreaktion wurde auf diesen Partikel beobachtet.