Impacts of bystander cells and external Ca2+ on NK/CTL-mediated cytotoxicity

Abstract

Immune killer cells, mainly cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells, serve a crucial role in eliminating pathogen-infected cells and cancer cells. The specificity of immune cytotoxicity relies on the formation of the immunological synapse (IS) between the killer cell and the target. While killer cells search and eliminate targets, environmental components like the non-target bystander cells and extracellular calcium ([Ca2+]ex) are important factors relevant for the killer cell’ functions. To date, the impact of bystander cells and [Ca2+]ex on killer cell cytotoxicity remains poorly understood. To address this question, I investigated the role of the bystander cells and [Ca2+]ex for killer cell functions. In the first part of this work, I focused on bystander cells. I found that the presence of bystander cells enhanced the killing efficiency of both CTLs and NK cells without affecting the degranulation of cytotoxic lytic granules (LG). Live cell imaging showed that the killer cells migrate with a faster velocity and a higher persistence in the presence of bystander cells. The persistence, but not the velocity of killer cells was reduced by the blockade of integrin β chains 1, 2 and 7 on the killer cells with neutralizing antibodies. Furthermore, bystander cell-generated H2O2 elevates the killer cell migration velocity, but not the persistence and degranulation. In the second part, based on coworkers' observation, I investigated how [Ca2+]ex affects CTLmediated cytotoxicity. I reproduced that CTLs show the best killing when [Ca2+]ex was reduced to 130-800 μM, higher or lower [Ca2+]ex impaired the killing efficiency. The same tendency was confirmed for LG release in CTLs with the same [Ca2+]ex using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). I could show that the Ca2+ signal at the site where vesicles fused is lower than in the LG-free cytosol and the site a vesicle stayed non-fused. In summary, this work suggests that bystander cells enhance NK/CTL-mediated cytotoxicity by promoting killer cell migration through bystander-derived H2O2 and by killer cell β integrins. CTLs execute the cytotoxicity in a [Ca2+]ex dependent manner, and the release of LG correlates with a Ca2+ microdomain which contains relatively low Ca2+ at the IS. These results suggest a positive role of the bystander cells in facilitating killer cell to pinpoint the target, and uncover the potential utility of tuning [Ca2+]ex to modify killer cell cytotoxicity, therefore allowing new insights into the possible impact of the microenvironment on immune surveillance.

Die wesentlichen Killerzellen des Immunsystems, Zytotoxische T Lymphozyten (CTL) und Natürliche Killerzellen (NK), spielen eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Pathogen-infizierten Zellen und Krebszellen. Die Spezifizität der Zytotoxizität des Immunsystems hängt dabei von der erfolgreichen Bildung der Immunologischen Synapse (IS) zwischen Killer- und Zielzelle ab. Die Suche nach und Abtötung von Zielzellen wird wahrscheinlich von verschiedenen Faktoren des Mikromilieus beeinflusst: U.a. könnten sogenannte Bystanderzellen, die selbst nicht von den Killerzellen erkannt werden, wie auch die extrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]ex) eine wichtige Rolle für die Funktion der Killerzellen spielen. Beide Faktoren sind allerdings bis jetzt nicht eingehend untersucht worden. Daher hat meine Arbeit zum Ziel die Rolle von Bystanderzellen und von [Ca2+]ex auf die Funktion von Killerzellen zu analysieren. Im ersten Teil der Arbeit habe ich mich auf die Bystander-Zellen fokussiert. Ich habe herausgefunden, dass die Effizienz von CTL und NK Zellen bei der Abtötung von Zielzellen durch die Anwesenheit von Bystander-Zellen positiv beeinflusst wird, ohne dass diese dabei die Degranulation der lytischen Granula (LG) beeinflusst. Mittels bildgebender Verfahren konnte nachgewiesen werden, dass CTL und NK Zellen in der Anwesenheit von Bystander-Zellen schneller migrieren und dabei auch eine höhere Migrations-Persistenz aufweisen. Dabei wird die Persistenz nicht aber die Geschwindigkeit der Migration durch eine Blockade der Integrin β-Untereinheiten durch neutralisierende Antikörper reduziert. Im Gegensatz dazu erhöht H2O2, welches von den Bystander-Zellen produziert wird, die Geschwindigkeit aber nicht die Persistenz der Migration, ohne dabei die Degranulation der LG zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich die Abhängigkeit der CTL Zytotoxizität von [Ca2+]ex untersucht, basierend auf vorhandenen Ergebnissen von anderen Labormitgliedern Ich habe reproduziert, dass CTL bei einer [Ca2+]ex von etwa 130-800 μM ein Optimum bezüglich Zytotoxizität gegenüber Zielzellen haben, höheres oder niedrigeres [Ca2+]ex reduziert die Abtötungseffizienz. Dieselbe Abhängigkeit von [Ca2+]ex habe ich für die Freisetzung von LG an der IS mittels Totaler-Interner- Reflektions-Mikroskopie (TIRFM) gemessen. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass intrazelluläre Ca2+ Signale in Bereichen niedriger sind, in denen LG Fusion stattfindet, und höher in Bereichen, in denen keine Fusion stattfindet. Zusammenfassend zeigt die Arbeit, dass Bystander-Zellen die Zytotoxizität von CTL und NK Zellen erhöht, und zwar durch eine H2O2-abhängige Erhöhung der Migrationsgeschwindigkeit und eine Integrinabhängige Erhöhung der Migrationspersistenz. Die zytotoxische Funktion ist Ca2+- abhängig mit einem relativ niedrigen Ca2+-Optimum und relativ niedrigen Ca2+ Konzentrationen an der IS. Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Rolle von Bystander-Zellen bei Abtötung von Zielzellen hin, und sie zeigen eine Möglichkeit auf, [Ca2+]ex zu nutzen, um die Zytotoxizität der Killerzellen zu modulieren. Beide Ergebnisse unterstreichen darüber hinaus die fundamentale Rolle des Mikromilieus bei der Immunabwehr.