The N-terminus of Sec61p plays key roles in ER protein import and ERAD

Abstract

Sec61p is the channel-forming subunit of the heterotrimeric Sec61 complex that mediates co-translational protein import into the endoplasmic reticulum (ER). In yeast, proteins can also be post-translationally translocated by the hetero-heptameric Sec complex, composed of the Sec61 and Sec63 complexes. Sec61 is also a candidate for the dislocation channel for misfolded proteins from the ER to the cytosol during ER-associated degradation (ERAD). The structure of Sec61p is highly conserved, but the roles of its N-terminal acetylation and N-terminal amphipathic helix were unknown so far. To investigate the function of the Sec61p N-terminus, I deleted its amphipathic helix, or both the helix and N-acetylation site, and characterized these two mutants together with a sec61 mutant carrying a mutation of the N-terminal acetylation site previously shown to result in temperature-sensitivity and an ERAD defect. Mutation of the N-acetylation site on its own had no effect on protein import into the ER in intact cells. Yeast expressing sec61 without the N-terminal helix displayed severe growth and post-translational ER import defects. Nevertheless, the formation of Sec complexes was not affected. Instead, removal of the N-terminal helix compromised the integrity of heterotrimeric Sec61 complexes. My data show that the Sec61p N-terminal helix is required for post-translational protein import into the ER and Sec61 complex stability, whereas Sec61p N-terminal acetylation plays a role in ERAD.

Der heterotrimere Sec61-Proteinkomplex vermittelt die Translokation sekretorischer Proteine ins Endoplasmatische Reticulum (ER) und ist ein putativer Transportkanal fehlgefalteter Proteine aus dem ER ins Cytosol während der ER-assoziierten Proteindegradation (ERAD). Die Untereinheit Sec61p bildet den Kanal und vermittelt den cotranslationalen Proteinimport in das ER. Proteine können in Hefen auch posttranslational durch den heteroheptameren Sec-Komplex, bestehend aus dem Sec61- und dem Sec63‑Komplex, transloziert werden. Die Sec61p-Struktur ist hochkonserviert, aber die Funktion der N-Acetylierung und der N-terminalen amphipatischen Helix waren bisher nicht bekannt. Daher deletierte ich die Helix mit und ohne die Acetylierungsstelle und charakterisierte beide Mutanten zusammen mit einer kürzlich entdeckten sec61 Mutante, die in der N-terminalen Acetylierungsstelle mutiert ist, temperatursensitiv ist und ERAD-Defekte aufweist. Die Mutation der Acetylierungsstelle hatte keinen Effekt auf den Proteinimport ins ER intakter Zellen. Hefen, die sec61 ohne die N-terminale Helix exprimieren, zeigen einen starken Wachstums- und posttranslationalen ER-Importdefekt. Die Ausbildung des Sec-Komplexes war nicht betroffen, obwohl die Integrität des heterotrimeren Sec61-Komplexes beeinflusst war. Meine Daten belegen, dass die N-terminale Helix für den posttranslationalen Import ins ER und die Sec61-Komplexstabilität notwendig ist, wohingegen die N-Acetylierung eine Rolle in der ERAD spielt.