Development of an automated metabolite-based liquid chromatographic-high resolution tandem mass spectrometric drug screening procedure for urine and blood plasma

Abstract

In the presented thesis, development of an automated and comprehensive metabolite-based LC-HR-MS/MS screening procedure using OT technology for detection of drugs and poisons relevant in clinical and forensic toxicology is described. Therefore, new urine sample workup procedures based on automated on-line extraction by TurboFlow and simple dilution were developed and compared with established urine precipitation. After universal UHPLC separation, drugs and metabolites were detected and identified by an OT mass spectrometer operated in FS mode with positive/negative switching and subsequent DDA mode. Based on these conditions, a new mass spectral reference library with over 5,000 HR-MS/MS spectra containing about 2,000 parent compounds and 3,000 metabolites was developed. The screening approach was successfully applied to blood plasma. A new automated HR-MS/MS data evaluation considering accurate mass precursor ions, five most intense FIs, and full HR-MS/MS library spectra was established. The new LC-HR-MS/MS screening approach complements the existing GC-MS and LC-MSn screening procedures and is the basis for metabolism studies of various drug classes. It is successfully applied in daily routine analysis for GUS and adherence testing of hypertension patients. Analysis of thousands of patient samples showed robustness, selectivity, sensitivity, and specificity of the method.

Im Rahmen dieser Dissertation wird die Entwicklung eines automatisierten und umfangreichen, Metaboliten-basierten Screeningverfahrens mittels LC-HR-MS/MS-Technik unter Verwendung der Orbitrap-Technologie zum Nachweis von in der klinischen und forensischen Toxikologie relevanten Arznei- und Giftstoffen beschrieben. Hierzu wurden neuartige Probenaufarbeitungsverfahren für Urin basierend auf automatisierter Turbulent Flow Online Extraktion und einfacher Verdünnung entwickelt und mit der bereits etablierten Proteinfällung verglichen. Unter Verwendung einer universellen UHPLC Trennung wurden die Muttersubstanzen und Metaboliten detektiert und identifiziert mittels eines Orbitrap Massenspektrometer, das im Full-Scan-Modus abwechselnd positiv oder negativ ionisierte Analyten erfasste und anschließend im datenabhängigen Erfassungsmodus betrieben wurde. Unter Anwendung dieser Bedingungen entstand eine neue Referenzspektrenbibliothek mit inzwischen über 5.000 hochaufgelösten Massenspektren, die rund 2.000 Muttersubstanzen und 3,000 Metaboliten umfasst. Das Verfahren wurde erfolgreich auf das Screening im Blutplasma übertragen. Eine neue automatisierte Auswertung, die die akkuraten Massen der Vorläuferionen, die der fünf intensivsten Fragmentionen und die vollständigen, hochaufgelösten MS/MS Bibliotheksspektren berücksichtigt, wurde etabliert. Das neue LC-HR-MS/MS Screeningverfahren ergänzt die bestehenden GC-MS und LC-MSn Screeningverfahren und ist die Grundlage zur Aufklärung des Metabolismus von verschiedensten Subtanzklassen. Es wird erfolgreich in der täglichen Routineanalytik zum allgemeinen Screening auf unbekannte Substanzen und zur Überprüfung der Adhärenz von Bluthochdruckpatienten eingesetzt. Die Analyse tausender Patientenproben zeigte die Robustheit, Selektivität, Sensitivität und Spezifizität der Methode.