Investigation of bacterial secondary metabolite pathways

Abstract

This work covers studies on three bacterial secondary metabolites, which were investigated with bioinformatic, biochemical and biotechnological methods to obtain insights into the biosynthesis and their general relevance for pharmaceutical research. The biosynthesis of tomaymycin, a pyrrolo[4,2]benzodiazepine (PBD) relevant in anticancer drug development, was elucidated using in vitro reconstitution of the underlying enzymes. Furthermore, all biochemical steps were visualized on the intact protein using a novel mass spectrometry based method. Tilivalline, a toxin from K. oxytoca, is the causative agent in antibiotic associated hemorrhagic colitis (AAHC). The biosynthesis of the compound was elucidated using in vitro reconstitution as well as heterologous expression of the underlying gene cluster. Furthermore, inhibitors were identified that impair tilivalline production in K. oxytoca liquid culture and thus a road was paved for an anti-virulence strategy for AAHC. Further, a myxobacterial peptide antibiotic was investigated. This work identified the biosynthetic gene cluster and established a rigid biosynthetic model by bioinformatic analysis and labeling studies. The analysis of the gene cluster led to the identification of two independent resistance mechanisms that were further elucidated in an heterologous system and by in vitro reconstitution.

Die vorliegende Arbeit enthält Studien zu drei bakteriellen Sekundärmetaboliten, die mit bioinformatischen, biochemischen und biotechnologischen Methoden untersucht wurden, um diezugrundeliegende Biosynthese und die allgemeine Relevanz für die pharmazeutische Forschung aufzuklären. Die Biosynthese von Tomaymycin, einem füur die Entwicklung von Krebsmedikamenten relevantem Pyrrolo[4,2]benzodiazepin (PBD), wurde durch in vitro Rekonstitution der entsprechenden Enzyme aufgeklärt. Weiter wurden alle biochemischen Zwischenschritte auf dem intakten Protein durch den Einsatz einer neuen massenspektrometrischen Methode visualisiert.Tilivalline, ein Toxin aus K. oxytoca, ist der verantwortliche Stoff in der antibiotika assoziierten hemorrhagischen Colitis (AAHC). Die Biosynthese des Stoffes wurde durch in vitro Rekonstitution und dem Einsatz heterologer Expressionssysteme aufgeklärt. Weiter wurde Inhibitoren identifiziert, die die Tilivallinproduktion in Flüussigkultur von K. oxytoca beeinträchtigen. Dieses Ergebnis ermöglicht die Entwicklung einer anti-virulenz Strategie für die Behandlung von AAHC. Weiter wurde ein myxobakterielles Peptidantibiotikum untersucht. Die vorliegende Arbeit identifizierte das zugehörige Gencluster und etablierte ein schlüssiges Biosynthesemodell durch bioinformatische Methoden und Labeling-Studien. Die Analyse des Genclusters führte zur Identifikation von zwei unabhängigen Resistenzmechanismen, die durch heterologe Systeme und in vitro Rekonstitution weiter aufgeklärt wurden.