Development of assay systems for the identification and functional characterization of inhibitors targeting the transcriptional regulator PqsR of Pseudomonas aeruginosa

Abstract

The present thesis was directed at establishing assay systems for the characterization of PqsR and its ligands. The conducted reporter gene experiments identified various agonistic and antagonistic compounds with, high potency in Pseudomonas aeruginosa. As presented in publication B, an unexpected change in the functional activity could be explained by cell- mediated hydroxylation. This fact demonstrates how bacteria can inactivate an anti-virulence agent and turn it into a compound even favoring the virulence. The quinolone-based antagonists turned out to suffer from poor physicochemical properties, especially regarding water solubility. Publication A intended to address this issue and as a result, several compounds with improved solubility/antagonistic activity profile were obtained. Chapter 1 pointed towards exploring the origin of the inverse agonistic effects. Using a fluorescence polarization-based in vitro assay, it could be shown that these inverse agonistic characteristics are presumably caused by locking the regulator PqsR at a formerly unknown binding sequence on the promotor DNA. Furthermore, it was shown that the apo- and the agonist- liganded forms of PqsR occupy the same binding sequence, while the antagonist- liganded form binds to a more narrow region.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von Testsystemen zur Identifizierung und Charakterisierung von PqsR Liganden. Die durchgeführten Reportergenassay Experimente führten zur Identifikation verschiedener, agonistischer und antagonistischer Verbindungen mit teilweise nanomolaren Aktivitäten in Pseudomonas aeruginosa. Wie in Publikation B beschrieben, konnte der Verlust an Aktivität in Pseudomonas aeruginosa auf bakteriellen Metabolismus zurückgeführt werden. Eine gezielte Modifikation der Verbindung stellte die Aktivität wieder her. Publikation A verfolgte das Ziel, Verbindungen mit besserer Wasserlöslichkeit bei gleichzeitigem Erhalt der antagonistischen Aktivität herzustellen. Kapitel 1 beschäftigte sich mit dem Phänomen des inversen Agonismus, eine Wirkweise, die mehrere der hier beschriebenen PqsR Antagonisten besitzen. Mit Hilfe eines in vitro Fluoreszenzpolarisationsassays, konnte gezeigt werden, dass diese invers agonistischen Aktivitäten möglicherweise durch Einfrieren einer bestimmten Konformation des Regulators PqsR zustande kommen. Der Regulator bindet in Anwesenheit dieser inversen Agonisten an eine bisher unbekannte Bindestelle auf der Promotor DNA, wodurch eventuell produktive Interaktionen mit der RNA Polymerase verhindert werden.