Mitochondrial bioenergetics and transporter-mediated metabolism in Schizosaccharomyces pombe

Abstract

Currently we possess a limited understanding on mitochondrial transporters in the model organism Schizosaccharomyces pombe and of the nature and the extent of regulation that is exerted from these mitochondrial carrier proteins on mitochondrial and cytosolic pathways. A systems biology approach was applied towards dynamically quantifying the metabolism of NADH, FADH2 and NAD-linked substrates which spanned over three compartments (cytosol, mitochondrial intermembrane space and mitochondrial matrix) and was mediated by specific membrane-bound transporters. In particular, by utilizing a selective permeabilization method in cytosol-mimicking conditions, exogenous substrates were delivered in a targeted manner directly on the cytosolic side of the outer mitochondrial membrane. In this manner we could propose the existence of a dicarboxylate carrier protein docked on the inner mitochondrial membrane that could be specifically inhibited and also identify an outer mitochondrial membrane porin linking via metabolite channeling the cytosolic formation of NADH to its oxidation in the intermembrane mitochondrial space. Furthermore, the deletion of the genes encoding for the functional subunits of the mitochondrial pyruvate carrier (MPC) revealed in whole cells a metabolic bottleneck at the pyruvate node with extended metabolic implications for the ethanol and acetate biosynthetic pathways. Based on the in situ characterization of selectively permeabilized MPC-deficient strains we hypothesize that the MPC machinery is part of a larger transmembrane metabolon connecting pyruvate transport to mitochondrial respiration, ATP synthesis and exchange for cytosolic ADP. As such, the MPC could affect metabolic pathways in the cytosol and the mitochondrial matrix, influence the P/O ratio and reveal itself as part of an extended metabolon possibly regulating the Crabtree effect.

Derzeit ist unser Verständnis über mitochondriale Transporter bei dem Modelorganismus Schizosaccharomyces pombe noch sehr begrenzt, ebenso wie die Natur und der regulatorische Umfang von solchen mitochondrialen Carrier-Proteinen innerhalb mitochondrial- und zytosolisch-lokalisierten Stoffwechselwegen. Zur dynamischen Quantifizierung des Metabolismus von NADH, FADH2, und NAD-gekoppelten Substraten, der sich über drei Kompartimente erstreckt (Zytosol, mitochondrialer Intermembranraum und Matrix) und über Membran-gebundene Transporter vermittelt wird, wurde eine systembiologische Methode angewandt. Insbesondere wurden durch die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran unter zytosol-nachahmenden Bedingungen exogene Substrate gezielt auf die zytosolische Seite der mitochondrialen Außenmembran abgegeben. Dies führte zu der Annahme, dass ein Dikarbonsäure Membrantransporter existiert, der an der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert ist und spezifisch inhibiert werden kann. Gleichzeitig wurde ein Porin identifiziert, das sich an der mitochondrialen Außenmembran befindet und mittels Metabolit-Channeling die zytosolische Synthese von NADH in seine oxidierte Form im mitochondrialen Intermembranraum verknüpft. Darüber hinaus führte die Deletion der Gene für die funktionellen Untereinheiten des mitochondrialen Pyruvattransporters (MPC) am Pyruvatknotenpunkt zu einem metabolischen Bottleneck mit erweiterten metabolischen Auswirkungen auf die Ethanol- und Acetatstoffwechselwege. Basierend auf der in situ Charakterisierung, der selektiv-permeabilisierten Deletionsmutanten des mitochondrialen Pyruvattransporters, wurde die Hypothese erstellt, dass die MPC-Maschinerie Teil eines größeren Metabolons ist, das den Pyruvattransport zur mitochondrialen Atmungskette, die ATP Synthese, sowie deren Austausch zu zytosolischem ADP miteinander verknüpft. Dadurch kann die MPC Maschinerie enzymatische Aktivitäten, sowohl im Zytosol, als auch in der mitochondrialen Matrix beeinflussen, den P/O-Wert beeinflussen und als Teil eines Metabolons möglicherweise den Crabtree-Effekt regulieren.