Virtual reaction chambers as a tool for polymerase chain reaction and protein thermal shift assays

Abstract

IIn the frame of this thesis Virtual reaction chambers (VRCs) were analysed as a tool for polymerase chain reaction and protein analysis. VRCs are digital microfluidic reactors, consisting of a aqueous sample volume (100nL - 300 nL) encapsulated by an oil droplet ( 1microL). Firstly a portable system for the temperature manipulation and fluorescence measurement of VRCs was constructed for this thesis. Subsequently the device was used to perform polymerase chain reactions (PCR) from DNA as well as reverse transcription PCR from RNA. Furthermore two methods of multiplexed PCR were developed, one of which specifcally exploits the advantages of VRCs. Thus it can be concluded that virtual reaction chambers are a suitable tool for polymerase chain reaction of DNA and RNA especially for point-of-care applications. Furthermore a mathematical model based on chain growth was constructed to describe the PCR, with particular focus on the extension step. Additionally the heating device and fluorescence measurement were used to measure the thermal stability of proteins. Here advantage was taken of the fact that VRCs are easily superheatable. Thus proteins still stable at temperatures above 100°C can be measured using this system. This and the low sample consumption makes VRCs an ideal tool for screening purposes in protein analysis.

Im Rahmen dieser These wurden Virtual Reaction Chambers (VRCs) als Werkzeug für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) und die Analyse von Proteinen getestet. VRCs sind digitale, mikrofluidische Reaktionsvolumen die aus einem wässrigen Probevolumen (100 - 300nL) eingeschlossen von einem Öltropfen ( 1µL) bestehen. In einem ersten Schritt wurde ein tragbares System für die Temperaturmanipulation sowie Flureszensmessung von VRCs konstruiert. Im Folgenden wurde mit dem Gerät die Polymerase Kettenreaktion von DNA, sowie reverse transkriptions PCR von RNA durchgeführt. Im Weiteren wurden zwei Methoden zur multiplex PCR entwickelt, von denen eine die Vorteile von Virtual Reaction Chambers nutzt. Aus den Ergebnissen kann gefolgert werden, dass VRCs ein geeignetes Werkzeug für die PCR von DNA und RNA sind, im Besonderen für Point-of-Care Anwendungen. Außerdem wurde ein mathematisches Modell zur Beschreibung der Reaktion geschrieben. Das Modell basiert auf Chain-Growth Prozessen und ist im Besonderen auf den Elongination-Schritt der Reaktion fokussiert. In einem zweiten Teil wurde das entwickelte Gerät benutzt, um die Temperatur-Stabilität von Proteinen zu messen. Hier wurde ausgenutzt, dass VRCs eine einfache Möglichkeit zum Superheating von Flüssigkeiten bieten. Dadurch konnten Proteine gemessen werden, welche auch noch bei 100°C stabil sind. Dies und der niedrige Probenverbrauch machen aus VRCs ein geeignetes Werkzeug zur Analyse von Proteinen, insbesondere im Rahmen von Screening-Versuchen.