Identifizierung und Charakterisierung neuer Cytochrom P450 Systeme aus Bacillus megaterium DSM319

Abstract

Cytochrome P450 sind vielseitige Biokatalysatoren, die die regio- und stereospezifische Oxidation nicht-aktivierter Kohlenwasserstoffe katalysieren. In dem Genom des kürzlich sequenzierten Bacillus megaterium Stammes DSM319 wurden Gene identifiziert, die Cytochrome P450 und mögliche Redoxpartner kodieren. Drei Cytochrome P450, CYP106A1, CYP109E1 und CYP109A2, sowie acht potentielle autologe Redoxproteine, ein Flavodoxin (Fld), vier Ferredoxine und drei Ferredoxin Reduktasen, wurden kloniert, exprimiert und gereinigt. Fld und drei Ferredoxine waren in der Lage, die Aktivität der P450s zu unterstützen und stellen damit die ersten klonierten natürlichen Redoxpartner von Cytochromen P450 aus B. megaterium dar. Mittels qRT-PCR wurde eine Koexpression der P450s mit Fld unter Eisenmangel und mit einem Ferredoxin bei ausreichender Eisenversorgung nachgewiesen, so dass B. megaterium in Abhängigkeit des verfügbaren Eisens zwischen verschiedenen Redoxproteinen wechseln kann. Für alle drei Cytochrome konnten pharmazeutisch interessante Substrate wie Steroide, Terpene und Vitamin D3 identifiziert werden. Um ausreichende Mengen der Produkte für eine strukturelle Charakterisierung mittels NMR zur Verfügung zu stellen, wurden rekombinante B. megaterium MS941 Ganzzellbiokatalysatoren konstruiert, welche auch die Grundlage für einen biotechnologischen Einsatz der Cytochrom P450 Systeme bilden. Dabei konnte mit CYP109E1 die erste bakterielle Wildtyp 16β-Steroidhydroxylase identifiziert werden.

Cytochromes P450 are versatile biocatalysts that catalyze the regio- and stereospecific oxidation of non-activated hydrocarbons. In the genome of Bacillus megaterium DSM319, a strain who has recently been sequenced, genes encoding cytochromes P450 and potential redox partners of the cytochromes P450 were identified. Three cytochromes P450, CYP106A1, CYP109E1 und CYP109A2, and eight potential autologous redox proteins, one flavodoxin (Fld), four ferredoxins and three ferredoxin reductases, were cloned, expressed and purified. Fld and three ferredoxins were able to support the activity of the P450s displaying the first cloned natural redox partners of cytochromes P450 from B. megaterium. Using qRT-PCR a co-expression of the P450s with Fld under iron limiting conditions and with one ferredoxin under sufficient iron supply was demonstrated indicating that B. megaterium can switch between different redox proteins depending on the iron level. For all cytochromes pharmaceutically interesting substrates like steroids, terpenes und vitamin D3 were identified. In order to provide sufficient amounts of the products to characterize them structurally by NMR spectroscopy, recombinant B. megaterium MS941 whole-cell biocatalysts were constructed, which are also the basis for a biotechnological application of the cytochrome P450 systems. Thereby, CYP109E1 was identified as the first wildtype 16β-steroidhydroxylase.