A microwell array coated with dopaminergic cell adhesive film for single cell analysis in drug discovery

Abstract

Drug discovery requires prompt decision-making to identify which new chemical entities constitute viable new drug candidates and have a high likelihood of market success. Conventional in vitro cell-based screens sometimes provide misleading data that may not represent in vivo responses. We developed an array of microcellular platforms to provide a uniform environment for single-cell suspension, mimic in vivo functions, and demonstrate the biological effects of a drug on the chemistry of a single cell at the molecular level. Dopaminergic mesoporous inorganic-organic hybrid resin (HR4-DOPA) was used to coat the wells of 200-microwell plates fabricated for these experiments. The biocompatibility of HR4-DOPA was demonstrated by cell adhesion and viability assays. HeLa cell adhesion to the HR4-DOPA film was comparable to the controls: mesoporous inorganic-organic hybrid resin (HR4), ECM proteins (fibronectin and collagen IV), and glass. HeLa cell viability on HR4-DOPA was 86.1%, indicating insignificant growth inhibition. We also investigated the optimal microwell depth and cell concentration for HeLa single-cell occupancy: 25-µm-deep microwells at 1.0 × 10^6 cells/ml demonstrated 67.5% single-cell occupancy while providing sufficient cell-adhesive surface area for long-term cell culture (≥ 3000 µm^2). We obtained singly occupied microwells with only 5.9% array-to-array variation, thus providing adequate throughput for accurate quantification in advanced single-cell analyses. Arrays of HR4-DOPA-coated microwells can be used for high-throughput single-cell-based assays for drug discovery as a “bio-cell processor.” Given that the microwell arrays are integrated in a microfluidic biochip, they can mimic the in vivo microenvironment; we can thus predict in vivo responses through high-throughput, isolated single-cell analysis to assess cellular chemistry at the molecular level.

In der Medikamentenforschung ist eine schnelle Entscheidungsfindung erforderlich, um neue chemische Stoffe aus einem Kandidaten-Pool möglicher neuer Medikamente zu finden, die eine Chance auf Markteinführung haben. Konventionelle, in vitro, zell-basierte Methoden liefern oft irreführende Ergebnisse, die nicht der in vivo Antwort entsprechen. Wir haben ein Einzelzell Array in einer mikrofluidischen Platform entwickelt, das ein gleichförmiges Millieu für die Zellen bereit stellt, in vivo Funktionalität imitieren kann und biologische Effekte eines Medikaments auf die Chemie einer einzelnen Zelle auf molekularer Ebene demonstrieren kann. Ein dopaminerges, mesopores, inorganisches/organisches Harz (HR4-DOPA) wurde benutzt um die Microwells einer 200-Microwell-Platte zu beschichten. Die Biokompatibilität dieses Harzes wurde durch Zell-Adhäsions- und Viabilitäts-Experimente nachgewiesen. Die Anlagerung von HeLa Zellen an HR4-DOPA war vergleichbar mit der an den Vergleichssubstanzen: mit HR4 (Hybrides, mesoporöses, inorganisches/organisches Harz), mit Proteinen der extrazellulären Matrix (Fibronectin, Collagen IV) und mit biologischem Glas. Die Viabilität der HeLa Zellen auf HR4-DOPA lag dabei bei 86,1%, was auf eine geringe Wachstumshemmung hindeutet. Die optimale Tiefe der Wells und die optimal Anzahl der Zellen wurden ebenfalls untersucht, wobei eine Zellzahl von 1,0 × 106 Zellen/ml und eine Tiefe der Microwells von 25 µm die besten Ergebnisse lieferten mit einer Einzel-Zell Belegung der Wells von 67,5% und eine genügend große Fläche (≥ 3000 µm2) für die Zellanlagerung und Langzeit-Kultivierung bereit stellt. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war dabei hoch, lediglich 5,9% Abweichung wurde festgestellt. Somit liefert dieser Ansatz eine geeignete Methode für die exakte Bestimmung und Quantifizierung verschiedener zellulärer Prozesse bei der state-of-the-art Einzel-Zell Analyse. Anordnungen von HR4-DOPA beschichteten Microwells können für Hochdurchsatz Untersuchungen in der Medikamentenforschung als „Bio-Zell Prozessor“ verwendet werden. Vorausgesetzt die Microwells sind integriert in einen mikrofluidischen Biochip, können diese eine in vivo ähnliche Mikroumgebung bereit stellen für weiterführende Versuche. Somit wird es möglich, in vivo Reaktionen akkurat und in einem Hochdurchsatz Verfahren voraus zu sagen und zelluläre Reaktionen auf der molekularen Ebene zu testen.