Molekulare Evolution der 1,5-Anhydro-D-fructose-Reduktase aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5. zu verbesserter Thermostabilität und ihre Anwendung in der Synthese von D-Rhamnose und D-Mannose mit in situ-Cosubstrat-Regenerierung

Abstract

In dieser Arbeit sollte die biokatalytische Synthese von D-Mannose und D-Rhamnose durch zwei Redoxreaktionen entwickelt werden. Zuerst wurden D-Glucose/6-Deoxy-D-glucose mit Pyranose-2-Oxidase zu D-Glucoson/6-Deoxy-D-glucoson umgesetzt. Nach Reinigung wur- den beide Osone mit 1,5-Anhydro-D-fructose-Reduktase (AFR) aus S. morelense S-30.7.5. zu D-Mannose/D-Rhamnose reduziert. Da AFR NADPH-abhängig ist, wurde ein Cosubstrat- Regenerierungssystem mit Glucose-Dehydrogenase aus Pseudomonas spec. etabliert. Im Vergleich zu Regenerierungen mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wurde die Zyklen- zahl auf 325% gesteigert. Es wurden 244 g·L-1·d-1 D-Mannose synthetisiert. Dieses System ist die erste dokumentierte quantitative Biokonversion von 6-Deoxy-D-gluco- son mit AFR. Durch Glucose-Oxidase aus A. niger und gemischten Ionenaustauscher konnte die D-Rhamnose anschließend mit einer Ausbeute von 72% gereinigt werden. Für einen effizienteren Einsatz der AFR sollte ihre Thermostabilität erhöht werden. Durch ite- rative Sättigungsmutagenese wurden die Aminosäureaustausche K207P, E208P und E330V eingeführt, die die T5010 um 12,5°C auf 49,2°C erhöhten. Mittels error prone-PCR entstand die Variante AFR-G13A-M31V mit einer T5010 von 46,6°C. Der durch ortsgerichtete Mutagenese innerhalb der fingerprint-Region erzeugte Austausch M31V führte bei der Reduktion von 6-Deoxy-D-glucoson zu einer um 8 mol% erhöhten Aus- beute an D-Rhamnose bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 94 g·L-1·d-1 und einer T5010 von 44,9°C.

In this work the biocatalytic synthesis of D-mannose and D-rhamnose should be developed via two redox reactions. First, D-glucose/6-deoxy-D-glucose were oxidized with pyranose-2- oxidase to D-glucosone/6-deoxy-D-glucosone. After their purification, both osones were reduced to D-mannose/D-rhamnose with 1,5-anhydro-D-fructose reductase (AFR) from S. morelense S-30.7.5.. Since AFR is NADPH-dependent, a cosubstrate regeneration system with glucose dehydrogenase from Pseudomonas spec. was established. Compared to the regeneration with glucose-6-phosphate dehydrogenase, the number of NADPH- regeneration cycles raised to 325%. Besides 244 g·L-1·d-1 D-mannose were synthesized. This system is the first documented quantitative bioconversion of 6-deoxy-D-glucosone with AFR. By glucose oxidase from A. niger and mixed bed ion exchanger, D-rhamnose was subsequently purified with a yield of 72%. For a more efficient application of the enzyme its thermostability should be increased. The amino acid substitutions K207P, E208P and E330V, which were introduced by iterative saturation mutagenesis, enhanced AFR´s T5010 by 12.5°C up to 49.2°C. The variant AFR- G13A-M31V was generated via error prone-PCR and reached a T5010 of 46.6°C. The exchange M31V that is located within AFR´s fingerprint region was then introduced by site-directed mutagenesis and resulted in an 8% molar increment of D-rhamnose during the reduction of 6-deoxy-D-glucosone, with a space-time yield of 94 g·L-1·d-1 and a T5010 of 44.9°C.