Allosteric modulators directed to the PIF pockets of phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) and protein kinase C zeta (PKCz)

Abstract

The phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1), a master kinase in the PI3K signaling pathway, has gained importance as a potential therapeutic target for cancer since several of PDK1’s substrates regulate processes for tumor cell growth and survival. As an alternative to the ATP-competitive strategy, we proposed the regulatory PIF pocket on AGC kinases as a drug target site to develop allosteric inhibitors with greater kinase selectivity. A screening identification of a hit compound and its biological evaluation proved that small molecules can allosterically trigger PDK1 activity by modulating the phosphorylation-dependent conformational transition. The optimization approach yielded 3,5-diarylpent-2-enoic acids whose allosteric mechanism was proven using mutants and cocrystallography. In addition to the SAR study, we applied isothermal titration calorimetry to analyze binding energetics of allosteric activators. Structure-based drug design led to a second compound class containing a dicarboxyl-moiety with improved potency and selectivity. Using a prodrug strategy the cell activity and the proof of mechanism was established. Further structure optimization of 3,5-diarylpent-2-enoic acids provided new insights on inhibition efficacy of small molecules toward the atypical protein kinase C, PKCζ that can occur via binding the PIF pocket. These results demonstrated for the first time, that PIF pocket-directed ligands can be both activators and inhibitors of AGC kinases.

Die Phosphoinositol-abhängige Kinase 1 (PDK1), eine Masterkinase des PI3K Signalweges, stellt ein wichtiges therapeutisches Target für Krebs dar, da viele ihrer Substrate Prozesse der Krebsentstehung regulieren. Mit der Entdeckung der PIF-Tasche wurde ein allosterisches Zentrum der AGC Kinasen für die Entwicklung allosterischer Modulatoren, alternativ zur ATP kompetitiven Strategie, gefunden. Die Identifizierung einer Hitverbindung und deren biologische Evaluierung bestätigten, dass kleine Moleküle die PDK1-Aktivität durch Modulation phosphorylierungs-abhängiger Konformations-übergänge allosterisch triggern können. In einem Optimierungsprozess wurden 3,5-Diarylpent-2-ensäuren synthetisiert und deren allosterischer Mechanismus mit Mutanten und Kokrystallen bewiesen. Zusätzlich zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden mittels isothermaler Titrationskalorimetrie die Bindungsenergien der Aktivatoren bestimmt. Strukturbasiertes Wirkstoffdesign führte zu einer zweiten Verbindungsklasse, wobei mit einer zusätzlichen Carboxylgruppe die Steigerung der Potenz und der Selektivität erreicht wurde. Die Zellaktivität und der Proof of Mechanism der Substanzen konnten mittels einer Prodrug-Strategie bestimmt werden. Eine weitere Strukturoptimierung der 3,5-Diarylpent-2-ensäuren lieferte allosterische Inhibitoren der atypischen Proteinkinase C, PKCζ. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass die PIF-Tasche-Liganden sowohl als Aktivatoren als auch als Inhibitoren der AGC Kinasen fungieren können.