Assessment of in vitro cardiotoxicity using metabolomics and 13C metabolic flux analysis

Abstract

The potential of respiration measurements, metabolomics and 13C metabolic flux analysis (13CMFA) for the determination of drug-induced cardiotoxicity was analysed. Two cardiac in vitro models, namely murine HL-1 cells and human embryonic stem cell derived cardiomyocytes (hESC-CM) were applied for this purpose. Respiration measurement in HL-1 cells upon drug treatment revealed distinct EC50 profiles. The toxicity occurred either fast or with a delay. This effect was dependant on the mechanism of toxicity of the respective drugs. Metabolite profiling of HL-1 cells in response to sub-toxic drug concentrations was carried out by using HPLC. The considered metabolites included glucose, lactate, pyruvate and amino acids. The metabolic profiles were drug class dependant, as shown by multivariate statistics, thereby allowing classification of drugs according to their mechanisms of action. 13C-MFA was carried out to determine the effect of Ca2+ channel blocker verapamil and the cytostatic drug doxorubicin on the central metabolism at concentrations which were clinically relevant and non-toxic. Verapamil-treatment resulted in a highly efficient glucose metabolism in HL-1 cells. In both HL-1 cell and hESC-CM, doxorubicin-treatment resulted in an increased oxidative metabolism, most likely to avoid ATP-depletion. The obtained results potentially have pharmacological relevancy, but also provide novel strategies for preclinical toxicity determination of new drug compounds.

In dieser Arbeit wurde das Potential von Respirationsmessungen, Metabolomics-Anwendungen und 13C basierten metabolischen Flussanalysen (13C-MFA) zur Bestimmung von Medikamenteninduzierter Kardiotoxizität untersucht. Es wurden HL-1 Kardiomyozyten sowie aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnene Herzzellen (hESC-CM) als in vitro Modelle verwendet. Die Respirationsmessungen an HL-1 Zellen ergaben je nach Medikament sehr unterschiedliche EC50-Dynamiken. Der toxische Effekt trat entweder sehr schnell oder mit einer zeitlichen Verzögerung ein. Die EC50-Dynamiken waren von den Toxizitätsmechanismen der entsprechenden Medikamente abhängig. Die Erstellung von Metabolit-Profilen in HL-1 Zellen wurde nach Gabe von subtoxischen Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC durchgeführt. Es wurden Glukose, Laktat, Pyruvat sowie 20 Aminosäuren gemessen. Mit Hilfe multivariater statistischer Methoden konnten Medikamentenklassen-abhängige Metabolit-Profile bestimmt werden. 13C-MFA wurde angewandt, um den Einfluss des Kalziumkanal-Blockers Verapamil sowie des Zytostatikums Doxorubicin auf den Zentralstoffwechsel zu bestimmen. Die betrachteten Konzentrationen der Wirkstoffe waren sowohl klinisch relevant also auch nicht toxisch. Die Behandlung von HL-1 Zellen mit Verapamil resultierte in einer deutlich höheren Effizienz in der Glukosenutzung. Sowohl in hESC-CM als auch in HL-1 Zellen resultierte die Doxorubicin- Behandlung in einer Zunahme des oxidativen Stoffwechsels, welche wahrscheinlich der Aufrechterhaltung der intrazellulären ATP-Konzentration dient. Die erzielten Ergebnisse haben pharmakologische Relevanz und zeigen des Weiteren auch neue Strategien für präklinische Kardiotoxizitäts-Messungen von neuen Wirkstoffen.