Vergleichende Untersuchungen zur Optimierung von Kryokonservierungsprotokollen: Verbesserte funktionserhaltende Kryokonservierung für therapeutisch relevante Zellsysteme

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, neue Strategien zur funktionserhaltenden Kryokonservierung von differenzierten Immun- und differenzierbaren Stammzellen im Hinblick auf eine standardisierte therapeutische Verwendung zu entwickeln. Dazu wurden die dreidimensionale Struktur von humanen embryonalen Stammzell (hESC) Kolonien und der Einfluss der notwendigen Mausfibroblasten untersucht. Auch wurden die Effekte unterschiedlicher Zellpräparationen, der Zell-Substrat-Adhäsion und verschiedener Kühlraten auf die Membranintegrität von hESCs während der Kryokonservierung evaluiert. Innovative Mikroskopiemethoden ermöglichten die Untersuchung der Mechanismen, die während des Einfrierens mit reduzierter DMSO-Konzentration und in serumfreien Medien auf die Stammzellen wirken. Mit diesen Erkenntnissen wurde ein oberflächenbasiertes, serumfreies Vitrifikationsprotokoll etabliert, das die Vitalität und Pluripotenz nahezu vollständig erhält und für die Kryokonservierung einer großen Anzahl an hESCs geeignet ist. Weiterhin wurde ein proteinfreies, chemisch definiertes Kryo-medium gefunden, das die Eigenschaften und Funktion von adulten Stammzellen, sowie von Immunzellen aus dem Blut auch während einer Langzeitlagerung konserviert. Um eine sichere Aufbewahrung der Proben technisch zu gewährleisten, wurde ein neues Kryoröhrchen, das die Speicherung der Probeninformation mittels integrierten Speicherchips direkt an den Zellen ermöglicht, auf Funktionalitätserhalt und Überlebensrate der Zellen evaluiert.

Aim of this work was the development of new strategies for the cryopreservation of differentiated blood cells and human stem cells that still can evolve into various cell types with regard to standar-dized, therapeutic applications. Therefore, the three-dimensional structure of human embryonic stem cell (hESC) colonies and the influence of murine embryonic fibroblasts, necessary for a stable cultivation of hESCs, were investigated. Additionally, the effect of cell preparation methods, cell-substrate-contact, and different cooling rates on membrane integrity of hESCs was analyzed. Innovative optical methods enabled the observation of damage mechanisms during cryopreservation of cells with reduced DMSO concentration as well as in serum-free media. Based on these results, a surface-based and serum-free vitrification protocol maintaining viability and pluripotency could be established for the bulk cryopreservation of hESCs. Furthermore, use of a protein-free and fully chemically defined cryopreservation medium resulted in preserved cell function and cell characteristics for different human adult stem and blood cells, even after long-term storage. To provide technology for a safe and controlled storage of biological material, a new cryovial was evaluated that allows data storage of sample information directly connected to the cells. For this, cell functionality and viability were investigated after cryopreservation in these cryovials.