The secretome of primary human hepatocytes in an organotypic bioreactor culture for the identification of biomarkers of drug-induced hepatotoxicity

Abstract

In the presented thesis, a workflow for analysis of the extracellular proteome, or “secretome”, of primary human hepatocytes by a shotgun proteomics approach was developed. The secretome analysis on hepatocytes is of special interest for the pharmaceutical industry as well as medical services because secreted proteins could serve as biomarkers for drug-induced hepatotoxicity. The avoidance of fetal calf serum, a common supplement used for in vitro cell culture was shown to be a prerequisite for efficient secretome analysis because supplemented proteins severely hamper the identification of secreted proteins using mass-spectrometry (MS). The removal of high abundant proteins from the sample by immunodepletion, a common strategy for proteomic analysis of human plasma, was shown to increase the number of identified proteins to almost two-fold the number of identifications obtained without prior immunodepletion, paving the way for in-depth analysis of the secretome. A prefractionation step at the level of proteins and the combination of different MS-types and ionization methods tremendously enhanced the identifications but at the cost of analysis time as well as the fraction of secreted proteins. The elaborated workflow without prior prefractionation was applied to a standard monolayer culture and a promising in vitro cultivation technique in a 3-dimensional bioreactor mimicking the microenvironment of a real liver. With 109 and 160 proteins identified in monolayer and bioreactor cultures, respectively, the number of proteins likely to be secreted by hepatocytes into the extracellular space was much higher than described in the current literature. Furthermore, proteome analysis on extracellular proteins in the applied culture conditions confirmed the tissue-like behavior of primary hepatocytes in the three-dimensional cultivation. Differentially expressed proteins in the bioreactor culture after application of the reference drug diclofenac were detected by label-free quantification and most of the detected differences could be traced back to the underlying mechanism of toxicity proposed for this drug. In summary, the presented work provides a basis for further in-depth analysis of the primary human hepatocytes secretome for in vitro drug-testing and demonstrates the valuable contributions of proteomics to toxicological research.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine experimentelle Strategie zur Analyse des extrazellulären Proteoms („Sekretom“) von primären humanen Hepatozyten mittels „shotgun“ proteomics entwickelt. Die Analyse des Sekretoms von Hepatozyten ist von besonderer Bedeutung für die pharmazeutische Industrie sowie das Gesundheitswesen, da sekretierte Proteine als Biomarker für arzneimittelinduzierte Lebertoxizität verwendet werden können. Es wurde gezeigt, dass die Vermeidung von foetalem Kälberserum, einem gewöhnlich in der in vitro Zellkultur verwendeten Zusatz, eine Grundvorraussetzung für die effiziente Analyse der sekretierten Proteine darstellt, da die zugesetzten Proteine erheblich die Identifizierung sekretierter Proteine mittels Massenspektrometrie erschweren. Desweiteren erhöhte die Entfernung hoch abundanter Proteine aus den Proben mit Hilfe einer Immunodepletion, wie sie oft in der Proteomanalyse von menschlichem Serum Verwendung findet, die Anzahl an identifizierten Proteinen fast um das Doppelte und ebnete damit den Weg für eine detailliertere Analyse des Sekretoms. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Vorfraktionierung der Proteine sowie die Kombination verschiedener Massenspektrometertypen bzw. Ionisationsmethoden die Anzahl an Identifizierungen deutlich steigert, allerdings auf Kosten der benötigten Analysezeit und des Anteils an sekretierten Proteinen. Die erarbeitete analytische Strategie ohne vorherige Fraktionierung wurde sowohl auf Standardkultivierungen in Zellkulturflaschen, als auch auf eine vielversprechende Bioreaktortechnik angewendet, wobei letztere die dreidimensionale Umgebung in einer echten Leber nachahmt. 109 bzw. 160 sekretierte Proteine konnten in Standard- bzw. Bioreaktokulturen identifiziert werden, wesentlich mehr als es derzeitig in der Literatur für primäre humane Hepatozyten beschrieben wird. Desweiteren bestätigte die Analyse des extrazellulären Proteoms in den verwendeten Kultivierungstechniken das gewebeähnliche Verhalten der primären Leberzellen in der dreidimensionalen Bioreaktorkultur. Differentiell exprimierte Proteine in mit der Referenzsubstanz Diclofenac behandelten Bioreaktorkulturen wurden mittels labelfreier Quantifizierung bestimmt und konnten auf die zugrundeliegenden Toxizitätsmechanismen zurückgeführt werden, die für dieses Medikament bekannt sind. Zusammenfassend legt die vorliegende Arbeit den Grundstein für weitere umfassende Analysen des Sekretoms von Leberzellen für in vitro Wirkstofftests und veranschaulicht den wertvollen Beitrag der Proteomik für die toxikologische Forschung.