Organotypic functional cultures of human liver cells for long-term maintenance and assessment of drug-induced metabolome effects

Abstract

The goals of this thesis were (i) to establish and improve organotypic liver cell culture techniques for long-term pharmacological studies and (ii) to develop and apply a metabolomics based approach for the assessment of drug-induced effects. As first model, a 3D bioreactor system was characterized in terms of cell physiology and functionality. Primary human hepatocytes could be kept viable and functional for more than 2 weeks in this system. Optimization of the system allowed determination of oxygen uptake rates and viability. As second 3D system, a hanging drop method was successfully applied for the generation of organotypic cultures as high-throughput in vitro model for toxicity studies. For the investigation of drug-induced metabolic effects, a metabolomics approach based on GCTOF-MS combined with multivariate statistics was developed. In 2D cultures of primary human hepatocytes, both short-term (up to 4 days) and long-term (3 weeks) drug-induced effects were detected at clinically relevant concentrations, showing the sensitivity of the established method. Both 3D cultivation methods used in this thesis represent a step forward to organotypic cultures as in vitro alternatives to animals and are particularly suitable for the investigation of chronic toxicity. The established metabolomics approach is a sensitive tool to assess drug-induced changes even at subtoxic concentrations and can be applied to other cell types and cultivation systems in the future.

Die Ziele dieser Arbeit waren (i) die Etablierung und Verbesserung von organotypischen Leberzellkulturtechniken für pharmakologische Studien und (ii) die Entwicklung und Anwendung einer Metabolomics-Methode zur Detektion von Wirkstoff-induzierten Effekten. Als erstes Modell wurde ein 3D Bioreaktor in Hinblick auf Zellphysiologie und -funktionalität untersucht. Primäre Hepatozyten konnten über mehr als 2 Wochen vital und funktionell in diesem System kultiviert werden. Eine Systemoptimierung erlaubte die Bestimmung von Sauerstoffaufnahmeraten und Viabilität. Als zweites 3D System wurde die Methode des hängenden Tropfens erfolgreich zur Herstellung von organotypischen Kulturen für Toxizitätsstudien eingesetzt. Zur Untersuchung von Wirkstoff-induzierten metabolischen Effekten wurde in dieser Arbeit eine Metabolomics-Methode entwickelt, basierend auf einer Kombination von GCTOF-MS und multivariater Statistik. In 2D Kulturen von primären Hepatozyten wurden sowohl Kurzzeit- (bis zu 4 Tagen) als auch Langzeit- (3 Wochen) Effekte bei klinisch relevanten Konzentrationen nachgewiesen, was die Sensitivität der Methode zeigt. Beide 3D Systeme, die in dieser Arbeit eingesetzt wurden, sind als organotypische in vitro Alternativen zu Tierversuchen zur Untersuchung von chronischer Toxizität geeignet. Die etablierte Metabolomics-Methode ist eine sensitive Technik um Wirkstoff-induzierte, subtoxische Effekte zu detektieren und kann in Zukunft auf andere Zelltypen und -systeme angewendet werden.