Primary metabolism and its regulation in the human cell line AGE1.HN – application of metabolic flux analysis for improved biopharmaceutical production

Abstract

This thesis focused on generating a detailed understanding of the primary metabolism and its regulation in the novel human cell line AGE1.HN and the application of the acquired knowledge to improve biopharmaceutical production. The different issues that were addressed include (i) metabolic shifts during cultivation, (ii) metabolite channeling and metabolic fluxes during overflow metabolism, (iii) primary metabolism at various substrate levels and the effect of different substrate feeding on cell culture process and metabolism, (iv) adaptation of the metabolism to ammonia stress, (v) metabolism and metabolic burden imposed by recombinant α1-antitrypsin production, and (vi) improvement of metabolism and biopharmaceutical production in AGE1.HN. Several types of metabolic network modeling and metabolic flux analysis (MFA) were applied. A time resolved MFA approach was developed to analyze metabolic shifts over time. Stationary MFA using mass balances was used extensively to identify alterations in the metabolism induced by physiological perturbations. 13C tracers and 13C MFA were applied to get in-depth insights into metabolite channeling and compartmented fluxes in the metabolism. The presented results provide valuable guidance for improvement of AGE1.HN, in particular, and of the biopharmaceutical production in mammalian cells in general. Additionally, this thesis contributes to an improved understanding of metabolic regulation in human cells.

In dieser Arbeit wurden der Primärmetabolismus und dessen Regulation in der humanen Zelllinie AGE1.HN analysiert, wobei der Fokus auf der Anwendung des erworbenen Wissens zur Verbesserung der biopharmazeutischen Produktion lag. Folgende Aspekte wurden untersucht: (i) Veränderungen des Metabolismus im Kultivierungsverlauf, (ii) metabolische Flüsse unter Überflussbedingungen, (iii) Metabolismus und α1-Antitrypsin-Produktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen, (iv) Anpassung des Metabolismus an Ammonium-Stress, (v) zelluläre und metabolische Adaptation an die Produktion von rekombinantem α1-Antitrypsin und (vi) Verbesserung des Metabolismus und der biopharmazeutischen Produktion in AGE1.HN. Verschiedene Arten der Modellierung von metabolischen Netzwerken sowie der metabolischen Flussanalyse (MFA) wurden hierbei angewendet. Eine dynamische MFA Methode wurde zur Analyse metabolischer Veränderungen entwickelt. Stationäre MFA wurde verwendet um Anpassungen des Metabolismus zu charakterisieren. 13C Markierungsexperimente sowie 13C MFA wurden genutzt um detaillierte Einsichten in das Channeling von Metaboliten sowie in die metabolischen Flüsse innerhalb und zwischen verschiedenen Kompartimenten zu erlangen. Die Ergebnisse stellen eine wertvolle Basis zur weiteren Verbesserung der biopharmazeutischen Produktion in AGE1.HN sowie in anderen Säugerzellen dar. Die vorliegende Arbeit trägt zusätzlich zu einem besseren Verständnis der Metabolismus-Regulation in humanen Zellen bei.