Endozytose und intrazellulärer Toxintransport in Hefe- und Säugerzellen mittels fluoreszenzmarkierter K28-Varianten

Abstract

Das Toxin K28 wird von virusinfizierten Killerstämmen der Hefe Saccharomyces cerevisiae sekretiert und ist als alpha/beta-Heterodimer ein Mitglied der A/B Toxin-Familie. Nach Bindung an die Oberfläche sensitiver Zielzellen wird K28 durch Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen und retrograd durch den Sekretionsweg in das Zytosol transportiert. Dort wird die beta-Untereinheit proteasomal abgebaut, während alpha im Zellkern einen G1/S Zellzyklus-Arrest und schließlich den Zelltod auslöst. Die K28-Aufnahme und der intrazelluläre Transport werden durch den zellulären HDEL-Rezeptor Erd2p bestimmt, der die Zielsteuerung des Toxins von der Plasmamembran zum sekretorischen Weg der infizierten Zelle sicherstellt. Daher stellt K28 ein geeignetes Modell-Cargo zur Untersuchung der Endozytose in eukaryotischen Zellen dar. Um das Toxin-Trafficking aufzuklären, wurden biologisch aktive K28/mCherry-Fusionen in Pichia pastoris exprimiert und zur Verfolgung der Toxinbindung an die Hefezelle in vivo eingesetzt. Dabei stellte sich die beta-Untereinheit als Zellwand-bindende Komponente heraus. Die Plasmamembranlokalisation und die endozytotische Aufnahme des K28-Rezeptors Erd2p wurden durch fluoreszenzbasierte Kolokalisationstudien und quantitative Mobilitätsbestimmungen bestätigt. Die Erd2p-Endozytose wird durch mehrere Mechanismen reguliert, darunter der AP-2 Komplex, der zur K28-Aufnahme erforderlich ist und das erste Beispiel einer Beteiligung von AP-2 Komponenten an der Endozytose in Hefe darstellt.

K28 toxin, secreted by virus-infected killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, is a alpha/beta heterodimeric protein of the A/B toxin family. After initial binding to the surface of sensitive target cells, K28 is taken up by receptor-mediated endocytosis and transported retrogradely through the secretory pathway. Within the cytosol, the toxin's beta-subunit is proteasomally degraded, while alpha enters the nucleus and causes a G1/S cell cycle arrest and finally cell death. Both, toxin uptake and intracellular transport crucially depend on the cellular HDEL receptor Erd2p which ensures that the toxin is targeted from the plasma membrane to the secretory pathway of intoxicated cells. Thus K28 represents a powerful tool for general studies of endocytosis in eukaryotic cells. To elucidate its trafficking, biologically active K28/mCherry fusion proteins were expressed in Pichia pastoris and used to track the toxin's in vivo binding to the yeast cell. Thereby, the beta-subunit was confirmed to be the cell wall binding component. Plasma membrane localization and endocytic uptake of the K28 receptor Erd2p was approved by fluorescence-based colocalization studies and quantitative measurements of vesicle movement/mobility. Endocytosis of Erd2p was shown to be regulated by multiple mechanisms, amongst which the AP-2 complex was identified as central component required for K28/Erd2p internalisation, thus representing the first example for the involvement of AP-2 in endocytosis in yeast.