Functional expression of uridine diphospho glucuronosyltransferases in fission yeast

Abstract

Uridine diphospho (UDP) glucuronosyltransferases (UGTs) catalyze the transfer of a sugar moiety from UDP-sugar to endogenous or exogenous compounds. The water solubility of these substances is increased thereby and their excretion from the human body is facilitated. The resulting glycosides, mostly glucuronides, can be pharmacologically relevant and are therefore needed as purified metabolites as reference standards or for toxicity studies. In this work, a whole-cell biotransformation system using recombinant Schizosaccharomyces pombe for the production of glycosides is described. It is based on the coexpression of a single UGT isoform and human UDP glucose-6-dehydrogenase, which delivers UDP-glucuronic acid. The system existed for UGT1A9 and has been extended in this work to be established now for each of the 19 human (and one further polymorphic variant of UGT2B7) and one rat isoform. The system was applied for different purposes. In one study, the usage of alternative UDP-sugar cofactors was investigated and the glucosidation of ibuprofen was shown. Furthermore, enhanced glucoside production rates could be obtained by overexpression of the fission yeast gene fyu1, which was discovered to act as UDP glucose pyrophosphorylase. Investigations of glucuronidation properties of single isoforms and those of different functional groups were studied as well. So, the glucuronidation of two substrates, which just differed in their functional group, being a hydroxyl group or a thiol, was compared.

Uridin-diphospho (UDP) Glukuronosyltransferasen (UGTs) katalysieren den Transfer eines Zuckers von UDP-Zucker auf endogene oder exogene Stoffe. Dies erhöht deren Wasserlöslichkeit und erleichtert somit ihre Ausscheidung aus dem Körper. Die resultierenden Glykoside, meist Glukuronide, können pharmakologisch relevant sein und werden als Referenzstandards oder in Toxizitätsstudien benötigt. In dieser Arbeit wird ein Ganzzell-Biotransformationssystem mit rekombinanten S. pombe-Zellen für die Produktion von Glykosiden beschrieben. Es basiert auf der Koexpression einer einzelnen UGT-Isoform mit humaner UDP-Glukose-6-Dehydrogenase, die UDP-Glukuronsäure liefert. Das System war bereits im Vorfeld für UGT1A9 etabliert worden und wurde in dieser Arbeit erweitert auf alle 19 humane UGT-Isoformen (und eine weitere Variante von UGT2B7) sowie eine Ratten-UGT. Es wurde eingesetzt, um den Gebrauch alternativer UDP-Zucker Kofaktoren zu untersuchen. So konnte die Glukosidierung von Ibuprofen gezeigt werden. Weiter konnte die Glukosid Produktion durch die Überexpression des Spalthefe-Gens fyu1 erhöht werden. Dieses fungierte dabei als UDP-Glukose Pyrophosphorylase. Untersuchungen von Glukuronidierungs-Eigenschaften von einzelnen Isoformen und von verschiedenen funktionellen Gruppen wurden ebenfalls durchgeführt. So wurde die Glukuronidierung eines Substrates mit einer durch ein Thiol ersetzten Hydroxyl-Gruppe durch verschiedene UGT Isoformen verglichen.