Nicht invasive Charakterisierung von Differenzierungsprozessen in humanen Stammzellen

Abstract

Gegenstand dieser Arbeit war die vergleichende Charakterisierung der osteogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark (BM-MSCs), dem Fettgewebe (AT-MSCs) und dem Nabelschnurblut (CB-MSCs) mit der humanen embryonalen Stammzelllinie hES H1 in 2D und 3D in vitro Kulturen. Weiterhin wurde evaluiert, ob man Differenzierungsprozesse mit nicht invasiven Verfahren bestimmen kann. Die Charakterisierung der Stammzellen in 2D demonstrierte ein hohes osteogenes Potential in allen mesenchymalen Stammzellpopulationen, allerdings war das replikative Potential der CB-MSCs stark eingeschränkt. Für die osteogene Differenzierung der Stammzellen wurde ein trägerfreies 3D in vitro Modell (Sphäroid) etabliert. In diesem Modellsystem war es nicht möglich, die osteogene Differenzierung der hES H1-Zellen zu induzieren, obwohl diese Zellen in 2D-Zellkulturen erfolgreich in Osteoblasten differenzierbar waren. Die Untersuchung der Sphäroide mittels Impedanzspektroskopie demonstrierte charakteristische Veränderungen der Spektren infolge des Differenzierungs-prozesses. Die Heterogenität der osteogenen Sphäroide nahm mit fortschreitender Differenzierung zu, wobei AT-MSCs schneller differenzierten als BM-MSCs. Zelluläre Strukturen sowie fibrilläre ECM und deren Kalzifizierung wurden mittels akustischer Mikroskopie in 2D-Kulturen abgebildet. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die mechanischen Eigenschaften der Zellkulturen spezifisch für multipotente Differenzierungsprozesse waren.

The purpose of this study was a comparative characterization of the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow (BM-MSCs), adipose tissue (ATMSCs) and cord blood (CB-MSCs) and the human embryonic stem cell line hES H1 in 2D and 3D in vitro cultures. For the investigation of the differentiation process, non-invasive techniques were implemented and evaluated. The basic characterization of the stem cell cultures demonstrated a high osteogenic potential in all mesenchymal stem cell populations, but a reduced replicative capacity was shown in CB-MSCs. A self-contained 3D in vitro model (spheroid) for the osteogenic differentiation of the stem cells was established. In this in vitro model, it was not possible to induce osteogenic development of hES H1, while in 2D-cultures these cells differentiated into the osteogenic lineage successfully. The investigation of the spheroids by impedance spectroscopy demonstrated characteristic changes in the recorded spectra. The heterogeneity of the spheroids increased according to the differentiation process at which AT-MSCs differentiated faster than BM-MSCs. Acoustic microscopy aimed in investigation of differentiation processes in monolayer cultures detecting cell structures as well as fibres of ECM and its mineralization. Further, specific changes in the mechanical properties of these cells were demonstrated related to multipotent differentiation processes.