Etablierung der Chromatin-Immunopräzipitation für in vivo Untersuchungen der Genregulation durch Transkriptionsfaktoren bei der Honigbiene Apis mellifera

Abstract

Zur Analyse der Genregulation durch die Bindungen von Transkriptionsfaktoren an DNA, wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) für Gewebe in der Biene etabliert. Hierbei konnte durch gezielte Optimierung, bei gleicher Effizienz der CHIP-Methode, die Menge des notwendigen Gewebes um den Faktor 10 bis 50 reduziert werden. An den Creb- und Jun-like-Promotoren wurden Trankriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS) identifiziert und die Funktionalität der Methode demonstriert. Für den weitergehenden Einsatz der ChIP-Methode wurden Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor Creb für die Biene hergestellt. Die Anwendung der ChIP-Methode in Verbindung mit der Hochdurchsatzsequenzierung (ChIP-seq) liefert erste Hinweise auf genomweite Bindungsstellen des Activating-Transcription-Factor-2 (Atf-2) in neuronalen Zellen des Bienengehirns. Die Untersuchungen von TFBS aus der ChIP-seq und der Korrelation mit der mRNA Expression zeigen, dass für aussagekräftige Erklärungen zur genomweiten Genregulation, Experimente in einem viel größerem Maßstab notwendig sind. Die Grundlagen für solche zukünftigen Untersuchungen an kleinen Gewebeproben sind jetzt durch diese Arbeit geschaffen.

In this work a chromatin immunoprecipitation (ChIP) has been developed first time for brain tissue of the honey bee to examine the regulation of genes by the binding of transcription factors to DNA. The optimized ChIP protocoll enables experiments with very low amounts of tissue. Using ChIP, transcription factor binding sites (TFBS) at the promoters of the Creb and Jun-like genes were identified and the functionality of this method demonstrated. To broaden the application of the ChIP technique, honeybee Creb antibodies were developed. Combining the ChIP technique with high throughput sequencing (ChIP-seq) indicates genome wide distribution of binding sites of the activating transcription factor 2 (Atf-2) in neuronal cells of the honeybee brain. The performed low number experiments of transcription factor binding and the correlation to mRNA expression demands for extensive ChIP-seq experiments on a broad scale to get significant results. The foundation for these further studies is presented in this dissertation.