Metabolic network activity characterization using mass spectrometric methods

Abstract

Innovative methods were developed for metabolic network activity characterization using mass spectrometry. Metabolic flux analysis (MFA) and kinetics of metabolic networks were developed and applied to Corynebacterium glutamicum. A protocol to determine metabolic fluxes at low degree of labelling using gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) by the measurement of 13C enrichment in proteinogenic amino acid hydrolyzates was described. Kinetic isotope effects played an increasing role at low degree of labeling but could be corrected. From these corrected 13C enrichments In vivo fluxes in the central metabolism were determined by numerical optimization. The GC-C-IRMS-based method involving low labeling degree of expensive tracer substrate, e.g. 1%, is therefore promising for larger laboratory and industrial pilot scale fermentations.

Permeabilization of Corynebacterium glutamicum cells was investigated and optimized. Permeabilized cells are considered closer to the in-vivo situation than purified enzyme(s) for the study of kinetics. A novel strategy was developed for the determination of in-situ enzymatic network kinetics combining permeabilization and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of—flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) quantification. Quantification of small molecular mass metabolites in glycolysis and pentose-phosphate pathway using MALDI-TOF-MS with [U-13C6] glucose-6-phosphate as single internal standard was established. Signal suppression during MALDI analysis could be compensated by applying the standard addition method. Adding selected substrates and cofactors, kinetics of glycolysis and pentose-phosphate pathways were be characterized using this method.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Massenspektrometrie-basierte Methoden zur Charakterisierung der Aktivität metabolischer Netzwerke entwickelt, die zur Flussanalyse in metabolischen Netzwerken sowie zur Analyse der Kinetik metabolischer Netzwerke angewendet wurden. Die Methode zur Bestimmung metabolischer Flüsse basiert auf der Messung der 13C-Anreicherung in Aminosäuren von Proteinhydrolysaten mit Hilfe von GC-C-IRMS (gas-chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry). Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Bestimmung metabolischer Flüsse auch bei sehr geringen Mengen an 13C-markiertem Substrat möglich ist. Durch Messung der 13C-Anreicherung in Aminosäuren und Korrektur von Isotopen-Effekten sowie durch Anpassung der korrigierten Daten mit Hilfe numerischer Optimierungen, konnten in vivo Flussverteilungen im Zentralstoffwechsel bestimmt werden. Da bei der GC-C-IRMS basierten Methode nur sehr geringe Mengen an relativ teurem 13C markiertem Substrat benötigt werden (~1%), ist diese Methodik insbesondere für die Anwendung in größerem Maßstab geeignet.

Des Weiteren wurden Techniken zur Permeabiliserung von Corynebacterium glutamicum untersucht und optimiert. Generell sind permeabilisierte Zellen zur Bestimmung von in vivo Enzymkinetiken besser geeignet als isolierte und gereinigte Enzyme. Zur in situ Bestimmung von Kinetiken in enzymatischen Netzwerken wurde in dieser Arbeit eine Methode entwickelt, bei der die Enzymaktivität in permeabilisierten Zellen bestimmt wird und des Weiteren eine MALDI-TOF-MS-basierte Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten erfolgt. Die Quantifizierung von Metaboliten der Glykolyse und des Pentosephosphat-Wegs mittels MALDI-TOF-MS erfolgte mit Hilfe von [U-13C6] Glukose-6-Phosphat als internem Standard. Die bei der MALDI-Messung auftretenden Signal-Unterdrückungen konnten durch Zugabe des Standards korrigiert werden. Durch Messung der entsprechenden Metabolite sowie durch Bestimmung von intrazellulären Enyzmaktivitäten mit Hilfe geeigneter Substrate und Kofaktoren, konnten die Kinetiken von Glykolyse sowie des Pentose-Phosphatweg erfolgreich charakterisiert werden.