Expression der Galaktitol-Dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides D und Herstellung von aktiven Mutationen zur Immobilisierung auf Goldelektroden

Abstract

Die konstitutive Expression der Galaktitol-Dehydrogenase in der gain of function Mutante Rhodobacter sphaeroides D ist auf eine Sequenzverdopplung von 21 Nukleotiden upstream vom Gen zurückzuführen, was als Effekt die Bindung eines GntR-Regulatorproteins als Repressor verhindern oder die Einführung einer neuen Promotorsequenz erlauben würde. Die Untersuchungen zeigen, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit der neue Promotor für die Transkription verantwortlich ist. Die Strukturrelevanz von Mg2+-Ionen für die Bildung katalytisch aktiver GatDH-Tetramere konnte durch eine Variante nachgewiesen werden, die C-terminal um die drei Mg2+ komplexierenden Aminosäuren verkürzt war. Die Variante zeigte keine Aktivität mehr und neigte bei der Anreicherung zur Aggregatbildung, was eine ungeordnete Zusammenlagerung der Monomere belegt und eine strukturelle Untersuchung verhinderte. Zur gerichteten Immobilisierung an Goldelektroden wurde die GatDH mit einem N-terminalen Cystein-Tag versehen. Diese Variante wurde mit einer Ausbeute von über 4400 U/l exprimiert und bis zu einer Reinheit von 12,2 U/mg angereichert. Eine SPRMessung bewies die feste Bindung des Enzyms an die Goldoberfläche als Monolayer und CV-Messungen belegten katalytische Aktivität. Diese neuartige Enzymimmobilisierung ist die Grundlage für die Entwicklung eines Enzymreaktors mit elektrochemischer Cofaktor Regenerierung zur enantiomerenreinen Feinchemikalien-Herstellung mit immobilisierten Enzymen, Cofaktoren und Mediatoren.

A 21 nucleotide duplication sequence upstream of the gene is responsible for the constitutive expression of galactitol dehydrogenase in the gain of function mutant Rhodobacter sphaeroides D which could either hamper the binding of a GntR-repressor protein or allow the insertion of a new promoter sequence. Investigations show with high plausibility that the new promoter is responsible for the transcription. The structure relevance of Mg2+-ions for the formation of catalytically active GatDHtetramers could be demonstrated by a variant where the three C-terminal Mg2+ binding amino acids were removed. The variant was no longer active and showed a high tendency to accumulate during purification. Hence, a disordered clustering of the monomers was demonstrated and structural investigations were hampered. For a directed immobilization on gold electrodes the GatDH-enzyme was supplied with an N-terminal cysteine-tag. The variant was expressed with an activity yield of about 4400 U/l and purified to a specific activity of 12,2 U/mg. SPR-measurement confirmed the covalent binding of the enzyme to the gold surface as a monolayer and CV-measurements proofed the catalytic activity. This new principle of enzyme immobilization provides a basis for the development of an enzymatic bioreactor with electrochemical cofactor regeneration for the production of enantiopure fine chemicals with immobilized enzymes, cofactors and mediators.