Methodenentwicklung zur Bestimmung von intakten Proteinen und Proteomen

Abstract

Die Untersuchung der Zusammensetzung von Proteomen umfasst die Identifizierung und Quantifizierung aller Proteine innerhalb einer Zelle, eines Gewebes oder einer biologischen Flüssigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter genau definierten Bedingungen. Analytische Methoden zur Untersuchung dieser heterogenen Proben müssen aufgrund der immensen Komplexität und des großen dynamischen Konzentrationsbereiches der Proteine (bis 1:10^10) sehr effiziente Trennungen der Proteine in Kombination mit sehr nachweisstarken Detektionsmethoden aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene chromatographische Methoden speziell zur Trennung von intakten Proteinen entwickelt und optimiert. Hierzu wurde die Ionenpaar-Umkehrphasen mikro-Hochleistungsflüssigchromatographie (IP-RP-mikro-HPLC) gewählt. Die Detektion der Proteine wurde durch Massenspektrometrie(MS) unter Verwendung von Flugzeit-(TOF) oder Ionenfallen Massenanalysatoren gewährleistet. Außerdem wurde eine Chromatofokussierungs-Methode entwickelt und optimiert, mit der in Kopplung mit der beschriebenen IP-RP-mikro-HPLC-TOF-MS-Methode die multidimensionale Analyse von komplexen Proteomen auf der Ebene der intakten Proteine möglich war. Alle entwickelten HPLC- und MS-Methoden wurden auf Reproduzierbarkeit, Stabilität sowie Orthogonalität getestet. Sie wurden angewendet zur Charakterisierung glycosylierter Proteine sowie zur Trennung und Detektion von Proteinen aus menschlichem Serum und einem Escherichia coli-Lysat. Außerdem wurden Molkeproben und ein Gliadinextrakt aus Weizenmehl qualitativ und quantitativ untersucht.

Proteome analysis includes the identification and quantitation of all proteins in a cell, tissue, or biological fluid at a given time point and under well defined conditions. Because of the immense complexity and the broad dynamic concentration range of the proteins (up to 1:10^10), analytical methods for investing these heterogeneous samples must enable highly efficient separations of proteins in combination with highly sensitive detection methods. This thesis describes the development and optimization of different chromatographic methods for the separation of intact proteins. Ion-pair reversed-phase micro high performance-liquid chromatography (IP-RP-micro-HPLC) was chosen and hyphenated to mass spectrometric (MS) detection using time-of-flight (TOF) and ion trap mass analyzers. Moreover, a chromatofocusing method was developed and optimized. In combination with the described IP-RP-micro-HPLC-TOF-MS method, the chromatofocusing method allowed the multidimensional analysis of intact proteins in complex proteomes. All developed methods were evaluated with regard to reproducibility, robustness, as well as orthogonality. They were employed to the characterization of glycosylated proteins and for the separation and detection of proteins in human serum and in an Escherichia coli lysate. Furthermore whey samples and an an extract of gliadins from wheat flour were qualitatively and quantitatively analyzed.