Untersuchungen der Photostabilität von BODIPY Farbstoffen durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)

Abstract

In der Einzelmolekülspektroskopie spielt die Photostabilität der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe eine wichtige Rolle, da Photobleichen die mögliche Beobachtungszeit einer fluoreszierenden Substanz vermindert. Um die Photostabilitäten von drei oft verwendeten Farbstoffklassen (Fluoreszeine, Bodipyfarbstoffe und Rhodamine) miteinander vergleichen zu können, wurde die Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie angewandt. Diese gibt Aufschluss über das diffusive Verhalten einzelner Farbstoffmoleküle. Bleicht ein Molekül während seiner Beobachtungszeit, wird es nicht mehr detektiert und seine Diffusionszeit vermindert sich. Um diese Änderung ausschließlich auf Bleichprozesse zurückführen zu können, wurde ein neuer verbesserter experimenteller Aufbau verwirklicht. Bis dato auftretende Artefakte wurden minimiert. Qualitative Aussagen über die Photostabilität der Farbstoffe wurden ermöglicht, indem die kinetische Analyse der Diffusionszeiten für verschiedene Parameter korrigiert wurde. Diese Korrekturen beinhalten Dejustierung, Sättigung und durchlaufene Anzahl an Photozyklen. Ein bisher vernachlässigter Bleichkanal (aus dem ersten angeregten Zustand S1) spielt entgegen der in der Literatur häufig vertretenen Meinung eine wichtige Rolle in Einzelmolekülexperimenten. Im direkten Vergleich sind Rhodamine stabiler als Bodipyfarbstoffe und Fluoreszeine, wobei die Photostabilität der Bodipyfarbstoffe diejenige der Fluoreszeine wiederum übertrifft.

In single-molecule applications, photostability of fluorescent molecules is a key parameter, as photobleaching reduces the possible observation time of a fluorescing substance. In order to compare the photostability of three commonly used classes of fluorescent dyes (fluoresceines, bodipy dyes and rhodamines), we applied Fluorescence Correlation Spectroscopy. This method gives information about the diffusive behaviour of single dye molecules. If a molecule undergoes bleaching during its observation time, it will not become detected anymore and its diffusion time decreases. In order to relate this decline to the amount of photobleaching, a new improved experimental setup was designed. By that, known experimental artefacts were minimized. It was possible to obtain qualitative results about the photostability of the dyes by correcting for different parameters in the kinetic analysis of the diffusion times. Among these are maladjustment, saturation effects and number of photocycles. A so far disregarded channel for bleaching reactions (out of the first excited state S1) was found to play an important role in single molecule experiments - contrary to the popular opinion in literature. It was found that rhodamine dyes are more stable than bodipy dyes and fluoresceines, whereas the photostability of the bodipy dyes exceeds the one of the fluoresceines.