Metal and inhibitor binding studies on metallo-beta-lactamases

Abstract

The heterogeneity of the metal content observed in Metallo-ß-Lactamases (MBLs) hampers the design of potential inhibitors. In the first part of the work, three representative members of the MBLs, namely BcII, CphA and L1 were investigated using mass spectrometric and spectroscopic methods. Experimental parameters for the detection of the metal-protein and ternary metalloprotein-inhibitor complexes using ESI-MS1 were evaluated and optimized. SAR1 determined in the gas phase were in agreement with kinetic assays performed in solution. This demonstrates the suitability of this technique for the screening for new inhibitors of MBLs and for the detection of metal:enzyme:inhibitor ratios. Competition-titrations in combination with ESI-MS, revealed that for different subclasses of the MBL, the inhibition by (R,S)-thiomandelate and D-captopril is strongly influenced by the nature of the metal ion and the metal content of the protein. In the second part of the work, the metal ion dependent flexibility of different parts of the BcII protein was investigated using HDX-MS1. It was shown that the metal-free enzyme was the least ordered structure and that the high flexibility at the metal binding site and the domain interface region in the Cd1-enzyme might facilitate the transfer of the metal between the two binding sites. These findings deliver important parameters for future development of efficient inhibitors for these enzymes.

Die heterogene Metallbesetzung in Metallo-ß-Lactamasen (MBLs) ist einer der Hauptgründe für den bislang geringen Erfolg bei der Entwicklung effizienter Inhibitoren für diese Enzymklasse. Im ersten Teil der Arbeit wurden drei repräsentative Vertreter der MBLs (BcII, CphA und L1) mit massenspektrometrischen und spektroskopischen Methoden untersucht. Es wurden Methoden der "nicht denaturierenden" ESI-MS1 für den Nachweis von Metall-Protein- sowie ternärer Metallprotein-Inhibitor-Interaktionen entwickelt.Die mittels ESI-MS in der Gasphase ermittelten SAR1 stimmten sehr gut mit den zuvor in Lösung ermittelten überein. Somit konnte gezeigt werden, dass ESI-MS eine geeignete Methode für die Bestimmung von Metall-Enzym-Inhibitor-Stöchiometrien und damit für die Identifizierung neuer effizienter Inhibitoren darstellt. Durch die Kombination von ESI-MS Experimenten mit Konkurrenztitrationen zeigte sich, dass die Hemmung verschiedener MBL-Subklassen mittels (R,S)-Thiomandelsäure und D-Captopril stark von der Art des gebundenen Metalls sowie von der Metall-Protein-Stöchiometrie beeinflusst wird. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mittels HDX-MS1 gezeigt werden, dass beim metallfreien Enzym die Sekundärstruktur am wenigsten ausgeprägt ist und dass das Cd1-BcII Enzym der metal-freien BcII Spezies sehr zu ähneln scheint, wenn nur das aktive Zentrum und die Interdomainen-Region betrachtet werden. Dies liefert ein tiefergehendes Verständnis der MBL sowie Grundlagen zur Entwicklung neuer Inhibitoren.