Polyketidbiosynthese in Myxobakterien

Abstract

Zu den wenigen von Myxobakterien produzierten biologisch aktiven reinen Polyketiden gehören Aurafuron und Spirangien. Beide weisen ungewöhnliche funktionale Gruppen auf: Aurafuron eine Furanon- und Spirangien eine Spiroketalstruktur. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese dieser Verbindungen durch Typ I Polyketidsynthasen (PKS) in S. aurantiaca DW4/3-1 bzw. S. cellulosum So ce90 untersucht. Das Spirangien-Biosynthesegenclusters war zu Beginn der Arbeit nur zur Hälfte bekannt, die unbekannte Sequenz wurde nach Hybridisierung einer generierten genomischen Bibliothek mit einer spezifischen Sonde identifiziert und sequenziert. Beide Biosynthesegencluster wurden sowohl durch in silico Analysen, als auch durch zielgerichtete Mutagenesen einzelner Biosynthesegene funktional charakterisiert. Die Aurafuron-Biosynthese in S. aurantiaca DW4/3-1 folgt nicht dem Kolinearitätsprinzip und schließt höchstwahrscheinlich die bisher selten beschriebene iterative Nutzung eines PKS-Modules ein. An der Post-PKS Biosynthese sind vier Oxidoreduktasen beteiligt, von denen eine möglicherweise eine Baeyer-Villiger Oxygenase darstellt. Mindestens zwei zusätzliche Aurafuron-Derivate wurden identifiziert. Der Vergleich der Biosynthesegene mit denjenigen von Aurafuron-ähnlichen Verbindungen aus Streptomyces sp. weist darauf hin, dass sich die Biosynthesewege größtenteils unabhängig voneinander entwickelt haben. Die Spirangien-Biosynthese in S. cellulosum So ce90 folgt weitestgehend dem Kolinearitätsprinzip. Durch die Inaktivierung zweier Methyltransferasen wurde eine Reihe neuer Desmethylderivate generiert und nachfolgend strukturell charakterisiert. Die Ergebnisse der Inaktivierungen der Cytochrom P450 Monooxygenasen zeigen, dass diese Enzyme an der Bildung der Spiroketalfunktion beteiligt sind. Das Vorhandensein mehrerer größerer Sequenzwiederholungen im Biosynthesegencluster lässt darauf schliessen, dass während der evulotionären Entstehung des Genclusters mindestens drei Duplikationsereignisse stattgefunden haben. Im Laufe der Arbeit wurde eine Mutante identifiziert, welche verkürzte Spirangienderivate produziert. Die Ergebnisse der phänotypischen und genotypischen Charakterisierung dieser Mutante deuten darauf hin, dass eine spontane Mutation im Biosynthesegencluster die Produktion der neuen Derivate verursacht hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zudem mögliche regulatorische Proteine der Sekundärstoffproduktion in S. cellulosum So ce90 identifiziert und charakterisiert. Anhand der Ähnlichkeit zum Regulator der Chivosazolproduktion ChiR im sequenzierten Modellstamm S. cellulosum So ce56 konnte ein Gen (deoRA) identifiziert und sequenziert werden, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert. Die Inaktivierung von deoRA führte zum Verlust der Spirangienproduktion und zur deutlichen Minderung der Epothilonproduktion. Die Einbringung zweier alternativer Promotoren vor deoRA führte nicht zu einer Produktionssteigerung von Spirangien oder Epothilon. Daraus ist zu schliessen, dass DeoRA für die Produktion nicht limitierend ist. Eine Bindung von DeoRA an die Spirangien- und Epothilon-Promotorregion konnte nach heterologer Expression des Proteins in vitro nicht nachgewiesen werden. DeoRA beeinflusst die Transkription der Biosynthesegene mit hoher Wahrscheinlichkeit indirekt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Kenntnisse über den Ablauf und die Evolution der Aurafuron- und Spirangien-Biosynthese gewonnen werden. Zielgerichtete Mutagenesen führten zur Produktion neuer Naturstoffderivate. Die erstmalige Identifizierung eines Regulators der Sekundärstoffproduktion in S. cellulosum So ce90 ermöglicht weitere Untersuchungen zur Regulation der Sekundärstoffproduktion in dem Epothilon-Produzenten.

Only few of the biologically active compounds produced by myxobacteria are pure polyketides. Among these, aurafuron and spirangien display interesting functional groups: aurafuron a contains a furanone moiety and spirangien exhibits a spiroketal function. In this study, the biosynthesis of these compounds in S. aurantica DW4/3-1 and S. cellulosum So ce90 by type I polyketide synthases (PKSs) was investigated. The sequence of the spirangien biosynthetic gene locus was identified by screening of a genomic library with a specific probe and sequenced. The biosynthetic gene clusters were characterized by both, in silico analyses and the analysis of targeted gene inactivation experiments. Aurafuron biosynthesis in S. aurantica DW4/3-1 does not follow the canonical colinearity rule and most likely includes the iterative usage of a module, a feature that has only been rarely reported for type I PKS. Four oxidoreductases are involved in post-PKS biosynthesis, one of them is presumably acting as a Baeyer-Villiger monooxygenase. At least two so far unknown derivatives were identified. The comparison of the biosynthetic genes with such responsible for the formation of very similar compounds from Streptomyces sp. suggests that the biosynthetic pathways developed independently of each other. The biosynthesis of spirangien in S. cellulosum So ce90 is almost following the colinearity paradigm. The targeted inactivation of two methyltransferase encoding genes led to the production of novel desmethylderivatives that were subsequently structurally characterized. The results of inactivation experiments of cytochrome P450 monooxygenase encoding genes indicate that these enzymes are involved in the formation of the spiroketal moiety. The presence of large stretches of sequence repeats points to at least three duplication events which took place during the evolution of the biosynthetic gene locus. A mutant was identified that produces truncated spirangien derivatives. The phenotype and the genotype of the mutant were analyzed suggesting that a spontaneous mutation in the biosynthetic gene locus led to the production of the new derivatives. Within this study proteins with a putative regulatory function in S. cellulosum So ce90 secondary metabolism were identified and characterized. Taking advantage of the homology to the ChiR regulator of chivosazol biosynthesis in the sequenced model strain S. cellulosum So ce56, a transcription factor encoding gene (deoRA) was identified and sequenced. The inactivation of deoRA led to the abolishment of spirangien production and to a dramatic decrease in epothilon formation. The introduction of two alternative promoters upstream of deoRA did not enhance production levels of spirangien and epothilon. Thus DeoRA does not seem not to be limiting for the production of these metabolites. After heterologous expression of DeoRA, no binding to the spirangien and epothilon promoter regions could be observed in vitro, suggesting that DeoRA is not directly regulating transcription of the biosynthetic genes.

During this study insight was gained into the molecular basis and the evolution of aurafuron and spirangien biosynthesis. Targeted gene manipulation led to the production of novel derivatives of these natural products. For the first time a regulatory protein of secondary metabolite production in S. cellulosum So ce90 could be identified. This enables further studies on the regulation of secondary metabolite formation in the epothilon producer.