Development of multidimensional liquid chromatographic methods hyphenated to mass spectrometry, preparation and analysis of complex biological samples

Abstract

Immunoadsorbers based on monolithic epoxy-activated CIM disks have been developed in order to target biomarkers of heart diseases. The developed immunoadsorbers permitted to selectively isolate myoglobin and NT-proBNP from human serum. Anti-NT-proBNP-CIM disks permitted a quantitative isolation of NT-proBNP at concentrations down to 750 amol/µL in serum (R2 = 0.998). Six different restricted access materials have been evaluated with respect to their ability to remove hemoglobin from hemolysates. Experiments at different pH revealed that the retention of hemoglobin can be drastically diminished at pH 10.7. Because of better chemical stability at high pH, the polymeric Biotrap 500 MS RAM column was optimized for the analysis of hemolysates. The setup permits to quantitatively extract antibiotics from whole blood hemolysates at biologically relevant concentrations (200 pg/µL), and without carry-over of hemoglobin. A new 2D-HPLC-ESI-MS/MS setup for proteome analysis was developed. It consisted of a peptide separation by RP-HPLC at pH 10.0, followed by IP-RP-HPLC at pH 2.1. This new setup was compared with a classical SCX x IP-RP-HPLC setup. Separation repeatability is similar with both setups. The orthogonality between methods of separation is higher in the SCX x IP-RP-HPLC approach than in the RP x IP-RP-HPLC scheme. However, the better peptide distribution and separation efficiency achieved with the RP x IP-RP-HPLC setup permitted to identify significantly more peptides than with the classical SCX x IP-RP-HPLC setup. Both approaches are complementary and a combination of both setups permits to identify more peptides than replicate injections performed with a single setup.

Immunoadsorber, die auf monolithischen Epoxy-aktivierten CIM-Disks basieren, wurden entwickelt, um Biomarker für Herzkrankheiten nachweisen zu können. Die entwickelten Immunoadsorber erlaubten eine selektive Isolierung von Myoglobin und NT-proBNP aus menschlichen Serum. Anti-NT-proBNP-CIM-Disks ermöglichten die quantitative Isolierung von NT-proBNP mit Konzentrationen bis zu 750 amol/µL im Serum (R2 = 0,998). Sechs verschiedene "Restricted Access Materials" wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, bzgl. der Entfernung von Hämoglobin aus Hämolysaten untersucht. Experimente bei unterschiedlichen pH-Werten ergaben, dass die Retention von Hämoglobin bei einem pH Wert von 10,7 deutlich verkleinert werden kann. Aufgrund ihrer höheren chemischen Stabilität bei höheren pH-Werten wurde die polymere "Biotrap 500 MS RAM" für die Analyse von Hämolysaten optimiert. Die Methode ermöglicht die quantitative Extraktion von Antibiotika aus Gesamtblut Hämolysaten mit biologisch relevanten Konzentrationen (200 pg/µL), ohne die Verschleppung des Hämoglobins. Eine neue 2D-HPLC-ESI-MS/MS-Methode wurde für die Proteomanalyse entwickelt. Sie bestand aus einer Peptid-Trennung mittels RP-HPLC bei einem pH-Wert von 10,0 und anschließender IP-RP-HPLC bei einem pH-Wert von 2,1. Anschließend wurde diese neue Methode mit einer klassischen SCX x IP-RP-HPLC-Methode verglichen. Die Orthogonalität zwischen den beiden Trennmethoden bei der SCX x IP-RP-HPLC ist hierbei höher als bei der entsprechenden RP x IP-RP-HPLC-Methode. Allerdings erlaubt die bessere Verteilung der Peptide und die bessere Trenneffizienz der SCX x IP-RP-HPLC-Methode die Identifizierung einer höheren Anzahl an Peptiden. Beide Methoden sind komplementär, und eine Kombination beider Methoden erlaubt die Identifizierung einer größeren Anzahl an Peptiden als wiederholte Injektionen bei einer eindimensionalen Methode.