Biosynthesis and regulation of production of the antibiotic Myxovirescin A in Myxococcus xanthus DK1622

Abstract

Myxobacteria produce a variety of secondary metabolites displaying important biological activities. Recent sequencing of the Myxococcus xanthus DK1622 genome revealed its high potential for the production of secondary metabolites and led to the identification of the myxovirescin biosynthetic gene cluster. In silico analysis of myxovirescin megasynthetase resulted in the proposal that a number of discrete enzymes work together with the multimodular PKS to build myxovirescin scaffold, unique for the presence of two different beta-alkyl groups. To test the myxovirescin biosynthetic model, fourteen in-frame deletion mutants in the myxovirescin biosynthetic gene cluster were created, and their effects on the production of myxovirescin antibiotics evaluated by HPLC-MS analysis of the resulting mutant extracts. Novel myxovirescin analogues arising from certain mutant backgrounds were structurally elucidated to identify the specific positions of these modifications. In silico analysis of an additional 11 kb region encoded upstream from the myxovirescin gene clusters were proposed to be involved in the regulation of its production. Genetic disruption of a gene encoding for a serine/threonine kinase, and two additional genes encoding for proteins of unknown functions, were shown to positively regulate myxovirescin production.

Myxobakterien haben sich in den letzten drei Jahrzehnten als vielseitige Produzenten unterschiedlichster Sekundärmetaboliten (SM) mit zum Teil starker biologischer Wirkung erwiesen. Unter diesen Bakterien sind diverse Multiproduzenten bekannt, zu denen auch das Bakterium Myxococcus xanthus DK1622 zählt. Die erst vor kurzem abgeschlossene Sequenzierung des Gesamtgenoms von Myxococcus xanthus DK1622 zeigt das enorme Potential für die Produktion verschiedenster SMs. Auf diesem Weg konnte ebenfalls das Myxoverescin-Biosynthesegencluster identifiziert werden. Die annotierte Genomsequenz lieferte erste Möglichkeiten für eine in silico Analyse der Myxovirescin Megasynthase und führte zum Postulat eines möglichen Biosynthesewegs. In diesem bildet eine multimodulare PKS das Myxovirescin-Grundgerüst, welches nachträglich durch verschiedene separate Enzyme modifiziert wird. Diese Enzyme katalysieren den Einbau zweier ungewöhnlicher beta-Alkylgruppen. Um die Beteiligung des identifizierten Genclusters an der Myxovirescin-Biosynthese zu beweisen, wurden vierzehn "in-frame" Deletionsmutanten erzeugt. Die Auswirkung der jeweiligen Mutation auf die Produktion des Antibiotikums wurde mittels HPLC/MS Analyse der erhaltenen Kulturextrakte untersucht. Um in den neuen Myxovirescin-Derivaten die spezifische Veränderung innerhalb des Moleküls zu identifizieren, wurde deren Struktur aufgeklärt. Stromaufwärts des Biosynthesegenclusters konnte eine ca. 11 kb große genomische Region identifiziert werden, in der Gene kodiert sind, die möglicherweise regulatorische Auswirkungen auf die Myxovirescin-Produktion haben. Durch Geninaktivierungen, sowohl eines Serin/Threonin Kinase kodierenden Gens, als auch zweier Gene mit unbekannter Funktion, konnte eindeutig gezeigt werden, dass die jeweiligen Enzyme an der Produktionsregulation beteiligt sind.