The application of surface plasmon resonance (SPR) immuno-biosensors for medical diagnosis

Abstract

A biosensor is an analytical device to detect target analyte in a complex mixture by using high selectivity of biomolecules as the molecular recognition tool. Especially, the immunoaffinity (IA) biosensor exploits the highly specific and selective interaction between antigen and antibody for the detection of a target analyte. The surface plasmon resonance (SPR) sensor was used for label-free detection and real-time monitoring, and SpreetaTM was used for this work. The major objective of this work is the development of SPR biosensor for medical diagnosis with the features of a cost-effective test by 'additive assay';, short analysis time through 'simultaneous detection'; and high sensitivity by 'signal amplification';.

[1] First topic is a reuse method of IA biosensor called 'additive assay';. In the 'addtive assay'; method, the sample is repeatedly injected to the IA layer without removing the already bound analytes by chemical treatment and then the concentration of sample is calculated from the actually measured signal by using previously prepared correlation curve between the accumulated concentration of additively injected sample and accumulated signal which represents the number of occupied binding sites. The application of additive assay for real medical diagnosis was demonstrated by using tumor marker (CA 19-9) as a target analyte. When the concentrations of four samples were analyzed by using the correlation curve of CA 19-9, the average deviation of the calculated concentrations from the real concentrations was estimated to be 5.3 %.

[2] The second topic is the 'simultaneous detection'; which enables the detection of multiple analytes on the single sensor element with single sample treatment. In the 'simultaneous detection';, a sample with several analytes is treated to the single sensing region which has multiple receptors for each target analyte and then the concentrations of each analyte is analyzed sequentially by using the respective correlation between the concentration and signal. In this work, two simultaneous detection models (Model 1 and Model 2) were devised for the samples with the following composition: (1) one target analyte resulting in a sensor response without any label and the other analyte with only additional label (Model 1), (2) both target analytes requiring additional labels for detetion (Model 2). The real medical diagnosis based simultaneous detection (Model 2) was demonstrated by analysis of human chorionic gonadotropin (hCG) and human albumin (hA) in human urine for the diagnosis of preterm delivery of patients with diabetes. The hCG has been used for the qualitative pregnancy test. The hA can be used for diabetes, who have the steeply increased prevalence of preterm delivery. The average errors of analysis based on Model 2 were 6.5 and 5.9 % for hCG and hA, respectively.

[3] The third topic is the improvement of sensitivity and detection limit through two 'signal amplification'; methods by using mass label (A) and by the orientation control of IA layer (B): (A) The mass label attached to the already bound target analyte increases the total mass attached to the sensor surface and then it induces the increase of SPR signal. Among several labels, the amplification using the PAP complex was selected as the most efficient method. The feasibility of this signal amplification method was demonstrated by analysis of human hepatitis B virus (hHBV) antibody. The result from PAP method shows that the detection limit of SPR biosensor (0.64 nM) approached closely to cut-off value for medical diagnosis (0.24 nM) by using the commercial ELISA kit. (B) The sensitivities of immunosensors are known to be improved by the control of IA layer. As more target analytes can be attached to this controlled IA layer, the signal at the same concentration of target analyte can be increased. In this work, among several controlled IA layers, the NeutrAvidin-protein A complex on gold surface of SPR biosensor showed the highest surface density of receptor and ligand antibody. And the binding ratio of ligand per unit receptor antibody was also one of the highest values. When the NeutrAvidin-protein A complex was prepared on biotin-labelled SAM, the binding ratio of ligand per unit receptor was found to be significantly improved. For the feasibility test of orientation control, the NeutrAvidin-protein A complex was applied for the detection of a tumor marker, carcinoembryonic antigen (CEA). The sensitivity was improved to be 1.5-fold higher than bare gold surface and the detection limit of 30 ng/ml was achieved.

These results demonstrated the 'additive assay'; for cost-effective test, 'simultaneous detection'; for short analysis time and 'signal amplification'; for high sensitivity. The presented three methods in this study will be applied for the development of a practical SPR biosensor for the various medical diagnosis.

Immunoaffinitäts(IA)-Biosensoren machen sich die Eigenschaften von Antikörpern, hoch selektiv spezifische Antigene zu erkennen, zu Nutze. Eine solche IA-Oberfläche wurde in dieser Arbeit an einen Signalverstärker unter Verwendung von sich selbst generierenden Einzelschichten gekoppelt. Anschließend wurde ein Surface Plasmon Resonance (SPR) Sensorsystem (SpreetaTM) zur Echtzeit-Detektion von Molekül-Molekül-Wechselwirkugen verwendet. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, ein kostengünstiges SPR Biosensor-Diagnostik-Verfahren zu entwickeln, das eine geringe Analysezeit in Anspruch nimmt, eine simultane Detektion verschiedener Interaktionen erlaubt und darüber hinaus über eine hohe Sensitivität aufweist.

1) Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines "Additiven Assays". Ziel dieses Tests ist es, Sensorchips mit IA-Oberflächen ohne ein Austauschen des Chips oder den Einsatz von Regnerierungs-Chemikalien wieder verwenden zu können. Beim "Additiven Assay" wird die Probe mehrfach über den Sensor gegeben, ohne dass bereits gebundene Analyten durch chemische Substanzen entfernt werden. Die Konzentration eines Analyts in der Probe wird ermittelt, indem das nach mehrmaliger Injektion der Probe aufgezeichnete akkumulierte SPR- Signal mit einer Eichkurve verglichen wird, die aus der Wechselwirkung zwischen immobilisierten BSA und Anti-BSA gewonnen wurde. Die Anwendbarkeit dieser Methode in der medizinischen Diagnostik wurde anhand der Detektion des Tumor-Markers CA 19-9 gezeigt.

2) Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in der Entwicklung eines Biosensors, mit dem verschiedene Analyten simultan aus einer einzelnen Probe detektiert werden können. In der simultanen Detektionsmethode werden mehrere Analyten durch die jeweiligen spezifischen Antikörper, die auf derselben Sensor-Oberfläche immobilisiert sind, detektiert. Dabei werden zur Unterscheidung zwischen den jeweiligen spezifischen Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen die Analyten nachträglich mit einem Massemarker versehen. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Methoden zur simultanen Detektion angewendet. Modell 1: Verwendung einer Probe, die sowohl einen Analyt enthält, der aufgrund seiner Konzentration und Molekülgröße direkt mittels SPR detektiert werden kann als auch einen Analyt, der nachträglich mit einem Massemarker detektiert werden muss. Modell 2: beide Analyten müssen nachträglich und nacheinander mit verschiedenen Massemarkern detektiert werden. Die Anwendbarkeit dieser Modelle wurde anhand eines Testsystems bestehend aus einer IA-Oberfläche mit BSA und Anti-HRP sowie Proben, die Anti-BSA und HRP enthielten, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Modelle für die simultane Detektion von Analyten einsetzbar sind. Die klinische Relevanz von Modell 2 wurde für die Diagnose möglicher Frühgeburten von Diabetes-Patientinnen getestet, indem Urin-Proben auf das Vorhandensein von humanen Chorion-Gonadotropin (hCG) und humanen Albumin (hA) untersucht wurden.

3) Der dritte Teil der Arbeit hatte als Zielsetzung die Verbesserung der Sensitivität und der Detektionsgrenze des Biosensors. Dies sollte zum einen durch die Verwendung von bestimmten Massenmarkern und zum anderen durch das Generieren von orientierten IA-Oberflächen erreicht werden. Durch Massemarker wird die Molekülmasse des gebundenen Analyts vergrößert, was zu einer Verstärkung des SPR-Signals führt. Von den in dieser Arbeit getesteten Massemarkern gegen die jeweiligen Analyten wie z.B. sekundäre Antikörper, Avidin-biotinylierte-Antikörper und einen Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP) Komplex war die Signalverstärkung durch den PAP-Komplex am effektivsten. Die Anwendbarkeit dieses Markers für diagnostische Verfahren wurde durch Analyse von humanen Antikörpern gegen Hepatitis B Viren (hHBV) getestet. Es ist bekannt, dass die Sensitivität von Immunosensoren durch die Kontrolle der Orientierung und Dichte des Rezeptors auf der IA-Oberfläche erhöht werden kann. An eine gerichtete IA-Oberfläche können mehr Analyten binden, was zu einer Signalverstärkung verglichen mit anderen ungerichteten IAs führt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Rezeptor-Molekül-Dichte auf die Detektionseffizienz unter Verwendung verschiedener Oberflächen getestet. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt, dass eine mittels des NeutrAvidin-Protein A-Komplex generierte gerichtete IA-Oberfläche zu einer Verbesserung der Sensitivität durch Erniedringung des Detektionslimits führt.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit mit dem "Additiven Assay" ein kostengünstiger Biosensortest etabliert werden. Unter Verwendung einer simultanen Detektionsmethode wurde die Analysezeit für unterschiedliche Analyten entscheidend verringert und mit der angewendeten Signalamplifikationssmethode konnte die Sensitivität der Assays gesteigert werden.