Etablierung und Evaluierung eines Screeningsystems für die molekulare Evolution der Steroid-15beta-Hydroxylase (CYP106A2) aus Bacillus megaterium ATCC 13368

Abstract

Steroide spielen eine bedeutende Rolle als Arzneimittel. Die Produktion der Steroide stellt eine besondere Herausforderung dar, da sie spezifische Reaktionen am Steroidkörper erfordern. Dabei wird insbesondere für Hydroxylierungsreaktionen auf Mikroorganismen bzw. mikrobielle Enzyme zurückgegriffen, da diese die Hydroxylierungen im Gegensatz zu chemisch katalysierten Reaktionen äußerst regio- und stereospezifisch durchführen. Die mikrobiellen Enzyme sind z. T. gut an die Anforderungen des Einsatzes in der Produktion angepasst. Oftmals müssen die Mikroorganismen oder die Enzyme aber erst adaptiert werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Evaluierung eines Screeningsystems für die gerichtete Evolution eines Steroid-hydroxylierenden Enzyms, der 15beta-Hydroxylase (CYP106A2) aus Bacillus megaterium ATCC 13368. Dieses lösliche bakterielle Cytochrom P450 ist eines der wenigen bekannten und besser charakterisierten Steroid-hydroxylierenden Cytochrome P450, womit es ein hohes Potenzial für eine biotechnologische Nutzung hat. Durch die gerichtete Evolution wurden Mutanten mit veränderter Stereo- und Regioselektivität der Hydroxylierung sowie erhöhten Hydroxylierungsaktivitäten gewonnen.

Steroids play an important role as drugs. The production of the steroids is difficult due to the necessity of specific modifications on the steroid structure. Therefore, the activity of microorganisms or their enzymes is used to perform especially hydroxylation reactions. These enzymes catalyze the reactions with a high regio- and stereoselectivity. The enzymes are sometimes quite well adapted on the requirements of the industrial use. But often they have to become adapted on these requirements. The aim of this work was the development and the evaluation of a screening system for the directed evolution of a steroid-hydroxylating enzyme, the 15beta-hydroxylase (CYP106A2) from Bacillus megaterium ATCC 13368. This soluble bacterial enzyme is one of the few known and better characterized steroid-hydroxylating cytochromes P450. Therefore, it has a high potential for the use in biotechnological processes. Mutants with altered stereo- and regioselectivity of hydroxylation and increased hydroxylation activity are generated by the use of the directed evolution.