Establishment and characterization of an epithelial cell culture model for the respiratory tract relevant for in vitro studies of pulmonary drug absorption, targeting and development

Abstract

The presented thesis describes the establishment of a cell culture model, which can serve as a screening tool in pharmaceutical research studying drug application to the lungs. It starts with a review, which gives an extensive overview on currently available cell culture models of the respiratory tract. Cells were isolated from procine lung, grown as primary cultures on filter supports and identified as porcine alveolar epithelial cells (pAEpC). These cells grew to confluent monolayers with typical intercellular junctions. During the cultivation process, a change from heterogeneous morphology towards a monolayer predominated by type I and type II pneumocytes was observed. A maximal transepithelial resistance of about 2000 Ohm*cm² demonstrated the formation of a tight epithelial barrier. Permeation of marker compounds was reproducible throughout several cell preparations and the model proved successful in distinguishing between low and high permeable drugs. Based on these results quality control parameters were defined serving as threshold for the use of pAEpC monolayers in transport studies. Budesonide and triamcinilone acetonide were selected for permeation experiments, as examples for commercially available drugs, which are commonly administered to the lungs. Expression of P-glycoprotein (P-gp) was confirmed on protein level, although permeability studies revealed no polarity in transport of known P-gp substrates. The porcine alveolar epithelial primary cell culture shares major hallmarks of the mammalian alveolar epithelium and it is easily available and scaled up for drug screening. Filter-grown monolayers of pAEpC can be used to study drug transport across such artificial alveolar epithelium and may represent a suitable in vitro model for pulmonary drug absorption and delivery.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines Zellkulturmodells, das in der Pharmaforschung zum Studium pulmonal applizierter Arzneistoffe eingesetzt werden kann. Einleitend wird ein ausführlicher Überblick über weitere in vitro Modelle des Respirationstraktes gegeben. Aus der Schweinelunge isolierte Zellen wuchsen als Primärkultur auf Filtern und konnten als pulmonales Alveolarepithel (pAEpC) identifiziert werden. Sie entwickelten konfluente Monolayer mit typischen interzellulären Kontakten, wobei im Kulturverlauf aus einer zunächst morphologisch heterogenen Kultur eine Zellpopulation aus vornehmlich Typ I und Typ II Pneumozyten entstand. Ein elektrischer Widerstand von bis zu 2000 Ohm*cm² belegte die Ausbildung einer dichten Barriere. Permeations-Experimente über pAEpC Monolayer erlaubten eine Unterscheidung zwischen hoch- und niederpermeablen Arzneistoffen, auch bei Verwendung von Kulturen unterschiedlicher Präparationschargen. In diesem Rahmen wurden Parameter zur Qualitätskontrolle definiert, die als Grenzwert für den Einsatz von pAEpC Monolayern in Transportstudien dienten. Als Beispiele für kommerziell verfügbare Arzneistoffe, die über die Atemwege appliziert werden, wurden Budesonid und Triamcinolonacetonid untersucht. Die Expression von P-Glykoprotein wurde auf Protein-Ebene bestätigt, obwohl der Transport bekannter P-gp-Substrate in Permeabilitäts-Studien keine Polarität zeigte. Alveolare Schweine-Epithelzellen in Primärkultur weisen typische Merkmale des Alveolarepithels von Säugetieren auf. Sie sind leicht und in größerer Menge verfügbar, wie es für eine frühe Selektion potentieller Arzneistoffe erforderlich ist. Auf permeablen Filtermembranen kultivierte Monolayer können zu Transportstudien über solch ein künstliches Alveolarepithel genutzt werden und stellen ein geeignetes in vitro Modell für die Untersuchung pulmonaler Arzneistoff-Absorption und der Freisetzung am Wirkort dar.