Systembiotechnologische Studien an Corynebacterium glutamicum zur Charakerisierung der Methioninsynthese

Abstract

Die essentielle schwefelhaltige Aminosäure Methionin ist eine der wichtigsten Aminosäure zur Supplementierung von Tierfutter und hat einen geschätzten Weltmarkt von 1 — 1,4 Milliarden Euro. Methionin wird gegenwärtig ausschließlich in einer chemischen Synthese als Razemat hergestellt, wobei giftige Chemikalien zum Einsatz kommen. Ein biotechnologisches Verfahren könnte dies vermeiden und die reine L-Form produzieren. Allerdings wurde bislang noch kein Organismus isoliert oder optimiert, der Methionin in ausreichender Menge produziert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde vor diesem Hintergrund der Methioninmetabolismus in Corynebacterium glutamicum näher untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei sowohl in silico als auch in vivo Studien. Die in silico Analyse des Stoffwechsels lieferte wertvolle Informationen zur Stamm- und Prozessentwicklung. Durch die Berechnung der theoretischen Ausbeuten war es möglich, wichtige Grundrichtungen für die rationale Stammentwicklung festzulegen. Die Elementarmodenanalyse ermöglichte eine stöchiometrische Betrachtung der Methioninsynthese unter verschiedenen Bedingungen in C. glutamicum und Escherichia coli, den bedeutendsten Mikroorganismen für die industrielle Aminosäureproduktion. Die maximalen theoretischen Ausbeuten lagen für das Wildtypnetzwerk von C. glutamicum bei 49,3 % (C-mol C-mol-1) und für E. coli bei 52,0 % (C-mol C-mol-1). Die höhere Ausbeute bei E. coli führte zur Identifikation von Optimierungszielen in C. glutamicum. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Glycinspaltungsenzyms die theoretische Kohlenstoffausbeute für Methionin in C. glutamicum auf 57,1% (C-mol C-mol-1) deutlich steigern kann. Ferner konnten die maximalen Kohlenstoffausbeuten des metabolischen Netzwerkes von C. glutamicum auf unterschiedlich stark reduzierten Schwefel- und zusätzlichen C1-Quellen berechnet werden. So zeigte sich bei Kultivierung auf Thiosulfat, Glucose und Formiat eine theoretische Ausbeute von 66,3 %. Bei einer Kultivierung auf Methanthiol (CH3SH) und Glucose kann C. glutamicum Methionin sogar mit 90,9 % theoretischer Kohlenstoffausbeute synthetisieren. In weiteren Studien wurde der Einfluss des Erhaltungsstoffwechsels auf die theoretischen Ausbeuten untersucht. Es konnte berechnet werden, wie stark die theoretische Ausbeute vom Erhaltungsstoffwechsel abhängen wird. Besonders bei hohem Energiebedarf und geringen Produktbildungsraten wird dieser Faktor eine große Rolle spielen. Die Untersuchungen zeigten, dass ein biotechnologischer Methioninprozess durchaus mit der chemischen Synthese konkurrieren könnte. Im Mittelpunkt der in vivo Studien stand der Vergleich des Metaboloms, Proteoms und Fluxoms des Wildtyps von C. glutamicum mit einer Deletionsmutante, der der transkriptionelle Repressor McbR, das zentrale Regulatorprotein von Methioninsynthese, Sulfatreduktion und Cysteinsynthese fehlt. Die Deletion dieses Regulatorproteins wurde bislang als ein erster Schritt in der Stammoptimierung zur Methioninproduktion betrachtet. Allerdings wurde auch von diesem Stamm keine signifikante Menge an Methionin gebildet, weshalb die Auswirkungen des Regulatorknockouts im Detail untersucht werden sollten. Zum Stammvergleich wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Methoden zur Zellextraktion und Analyse der Intermediate des Methioninstoffwechsels von C. glutamicum entwickelt. Die eingehende Untersuchung intrazellulärer Metabolite zeigte die Akkumulation einer zunächst unbekannten Substanz in C. glutamicum mcbR. Diese Substanz konnte mittels GC/MS, 1H-NMR, 13C-NMR und 15N-, 13C- und 34S-Markierungsstudien als die ungewöhnliche schwefelhaltige Diaminosäure Homolanthionin identifiziert werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Cystathionin--Synthase, ein Enzym des Methioninstoffwechsels, für die Bildung von Homolanthionin verantwortlich ist. Grund ist eine geringe Substratspezifität, die bewirkt, dass Homocystein anstelle von Cystein mit O-Acetylhomoserin umgesetzt wird. Zusätzlich bewirkt die Akkumulation von Homolanthionin in der Zelle die Aktivierung eines neuen, erstmals beschriebenen Biosyntheseweges für Isoleucin, der von Threonin unabhängig abläuft. Der systembiologische Vergleich von C. glutamicum Wildtyp und mcbR zeigte neben der Akkumulation von Homolanthionin drastische Veränderungen von Metabolom, Fluxom und Proteom. So sind beispielsweise im C. glutamicum mcbR fast alle Intermediate der Methioninsynthese höher konzentriert und auch viele Enzyme der Methioninsynthese und der Sulfatreduktion induziert, wobei jedoch kein Methionin ins Medium abgegeben wird ...

The essential sulfur-containing amino acid methionine is one of the most important amino acids as supplement for animal feed. It has an estimated world market of 1 — 1.4 billion Euros. Currently methionine is exclusively produced as a racemic mixture in chemical synthesis, using hazardous chemicals. A biotechnological methionine production could avoid the use of these chemicals and additionally produce the pure L-isomer of methionine. However, so far it was not possible to isolate or optimize a methionine overproducing microorganism. In the present work the methionine metabolism of Corynebacterium glutamicum, one of the most important industrial amino acid producers, was therefore investigated in detail. The scope of this work comprised both in silico and in vivo studies. The in silico analysis of the metabolism provided valuable information for strain and process design. The calculation of theoretical yields allowed the determination of important strain improvement strategies. The elementary mode analysis made the comparison of the methionine production in C. glutamicum and Escherichia coli under different conditions possible. The wildtype networks of C. glutamicum and E. coli exhibited theoretical maximum yields of 49.3 % (C-mol C-mol-1) and 52.0 % (C-mol C-mol-1), respectively. The higher yield in the E. coli network led to the identification of targets for improvements in C. glutamicum. Thus, it could be shown that the introduction of a glycine cleavage system into C. glutamicum could significantly increase the theoretical yield to 57.1% (C-mol C-mol-1). Moreover, the yields on differently reduced sulfur sources and alternative C1-sources were calculated for the C. glutamicum network. It was found that cultivation on glucose, thiosulfate and formic acid could reach a theoretical yield of 66.3 %. During cultivation on methanethiol (CH3SH) and glucose C. glutamicum could be able to produce methionine with an even higher yield of 90.9 %. In additional studies the influence of maintenance energy was investigated. It was found that the high theoretical yields will depend on maintenance especially at a high maintenance energy demand and a low methionine secretion rate. The in silico studies showed, that a biotechnological methionine production could compete with the chemical synthesis. The in vivo analyses were focused on the in-depth profiling of C. glutamicum and a regulator knockout mutant, using metabolome, proteome and fluxome analysis. In the mutant, the gene of the transcriptional repressor protein McbR was deleted. This protein is the central regulator of the methionine and cysteine biosynthesis and the sulfur assimilation pathway. Its knockout was therefore considered as a central step in the development of a methionine overproducer. However, no significant amounts of methionine were produced by C. glutamicum mcbR, making an in-depth profiling essential. For this purpose different methods for cell extraction and analysis of intracellular metabolites, especially those related to methionine biosynthesis, were developed in the course of this work. The in-depth metabolome analysis showed the tremendous accumulation of an unknown compound in C. glutamicum mcbR. This compound could be identified as homolanthionine, using GC/MS, 1H-NMR, 13C-NMR and 15N-, 13C- and 34S-tracer studies. Additionally, it could be shown that cystathionine--synthase, an enzyme of the methionine biosynthesis, was responsible for the formation of homolanthionine. The reason is the poor substrate specifity of cystathionine--synthase causing the conversion of homocysteine instead of cysteine together with O-acetyl-homoserine. Besides this, the accumulation of homolanthionine activates a new, so far not described, route for isoleucine biosynthesis independent from threonine. In addition to the accumulation of homolanthionine the systems biological analysis of C. glutamicum wild type and mcbR showed drastic changes in the metabolome, fluxome and proteome of both strains ...