Programming probiotic lactobacilli towards next-generation probiotics

Abstract

Lactiplantibacillus plantarum is a probiotic bacterium widely known for its health-promoting properties and fermentation capabilities through the production of natural metabolites. Despite its inherent advantages, its broader utility remains constrained by two limitations: i) a challenging genetic transformation and ii) a limited genetic toolbox for enhanced genetic programmability. This thesis addresses the first gap by identifying the barriers limiting genetic transformation and developing a time-saving, direct cloning method in L. plantarum. This method is used to address the second gap, which focuses on exploring sources of genetic parts, ranging from bacteriophages to unexplored endogenous parts, and evaluating their performance to expand the genetic toolbox of L. plantarum. In this thesis, valuable genetic parts are discovered and combined to achieve high levels of constitutive and inducible gene expression, improved protein secretion, and tunable plasmid retention. Ultimately, the potential of the engineered bacteria for responsive drug delivery is evaluated within the context of Engineered Living Materials (ELMs). Thus, this thesis describes the development of methods and tools leading to the first lactobacilli-based ELM capable of switchable protein release. Beyond living therapeutics, the outcomes of this thesis might contribute to expanding the programmability of L. plantarum towards advances in metabolism research, biotechnological, and imaging applications.

Lactiplantibacillus plantarum ist ein probiotisches Bakterium, das für seine positiven Eigenschaften und seine Fähigkeit zur Fermentation durch die Produktion natürlicher Metaboliten bekannt ist. Seine breitere Anwendung wird jedoch durch zwei Einschränkungen begrenzt: i) eine aufwendige genetische Transformation und ii) ein begrenztes genetisches Werkzeugset für verbesserte Modifikationen. Diese Arbeit identifiziert und überwindet Hindernisse für die genetische Transformation durch die Entwicklung einer direkten Klonierungsmethode. Diese Methode dient dazu, die zweite Beschränkung zu bewältigen, indem sie die Suche nach genetischen Bausteinen und deren Leistungsfähigkeit zur Erweiterung des genetischen Werkzeugsets von L. plantarum ermöglicht. In dieser Arbeit werden wertvolle Bausteine entdeckt und kombiniert, um eine verbesserte konstitutive und induzierbare Genexpression, Proteinsekretion und Plasmidretention zu erreichen. Das Potenzial der gentechnisch veränderten Bakterien für die gezielte Wirkstofffreisetzung wird im Kontext von Engineered Living Materials (ELMs) evaluiert. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung von Werkzeugen, die zu Laktobazillen-basierten ELMs mit schaltbarer Proteinfreisetzung führen. Über die Anwendung als lebende Therapeutika hinaus könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Engineering von L. plantarum im Hinblick auf Fortschritte in der Stoffwechselforschung und biotechnologischen Anwendungen auszuweiten.