Expressionsbestimmungen des Novel INHAT Repressors NIR und des p63-Gens mit Protokolletablierung zum NIR-Knockdown in AML-Zelllinien

Abstract

In hämatologischen Zellen von Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie (AML) wurden Zellen gefunden, die den Novel INHAT Repressor NIR auf Proteinebene nicht exprimierten [8]. Dieses ubiquitär exprimierte Protein sorgt für eine Inhibierung der Histonacetylierung [23], blockiert so eine Auflockerung der Histonbindungen und daraus resultierend eine erleichterte Gentranskription [29]. NIR wirkt zusammengefasst als Repressor der Transkriptionsinitiation [20] [23]. Auch nach weiteren Untersuchungen stellten wir fest, dass manche AML-Zelllinien NIR nicht exprimieren. Diese Entdeckung war verwunderlich, da bis zu diesem Zeitpunkt davon ausgegangen wurde, dass Zellen ohne das NIR-Protein nicht überlebensfähig sind [33] [11] [21]. Vorausgegangene Arbeiten hatten gezeigt, dass es durch einen NIR-Knockout bei Mäusen zu einer gestörten Embryogenese kommt, sodass alle Maus-Embryonen sterben [11] [21]. Ein dauerhafter NIR-Knockdown wird auch von den meisten Zelltypen nicht toleriert [21]. Eine Ausnahme von dieser Regel scheint die AML zu bilden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche der untersuchten AML-Zellen eine NIR- und eine p63-Expression auf Protein- und Transkriptionsebene aufweisen. Wir untersuchten, ob ein Zusammenhang zwischen NIR- und p63-Expression existiert und auf welcher Ebene dieser lokalisiert ist. Nach Kultivierung der AML-Zelllinien verwendeten wir hierfür Standard-Wester-Immunoblots und quantitative Real-Time-PCRs. Außerdem sollte ein Protokoll für die Methode der Gymnosis mittels LNA-GapmeRs zum Herbeiführen eines Knockdowns in AML-Zellen etabliert werden. Hierbei handelte es sich um eine unassistierte Aufnahme von antisense-DNA-Molekülen, d. h. ohne den Einsatz von Transfektionsreagenzien in die Zelle [46]. Wir konnten zeigen, dass mit den beiden AML-Zelllinien HL60 und HNT34 entgegen vorheriger Annahmen Zellen existieren, die weder NIR-Protein noch -Transkript exprimieren. Alle getesteten AML-Zelllinien zeigten außerdem eine unterschiedlich stark ausgeprägte NIR-p63-Antikorrelation auf Protein- und Transkriptebene, sodass bei starker NIR-Expression keine oder nur eine geringe p63-Expression vorhanden ist und vice versa. Es ließ sich feststellen, dass dieser antagonistische Zusammenhang zwischen NIR und p63 auf Transkriptebene lokalisiert ist. Desweitern konnten wir erfolgreich ein Protokoll für die Gymnosis mittels LNA-GapmeRs an der AML-Zelllinie der NB4-Zellen etablieren. Nach einer bis zu 7-tägigen Behandlung der AML-Zellen ließ sich die Menge des NIR-Transkriptes um bis zu 77 % reduzieren. Zukünftige Studien mit der Frage nach Ausweitung der hier vorhandenen Ergebnisse auf weitere AML-Zelllinien könnten zu einem besseren Verständnis des NIR-Proteins, dessen Rolle bei der AML und möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansätzen führen. Mit der Etablierung eines Protokolls zur Herbeiführung eines Knockdowns in AML-Zellen konnten wir für weitere Untersuchungen diesbezüglich ein Werkzeug an die Hand geben.

It was discovered that the Novel INHAT Repressor NIR was not expressed at the protein level in some of the hematological cells from patients with acute myeloid leukaemia [8]. This ubiquitously expressed protein inhibits histone acetylation [23], thus blocking loosened histone binding and resulting in facilitated gene transcription [29]. In summary, NIR acts as a repressor of transcription initiation [20] [23]. Our further investigation also revealed that some AML cell lines do not express NIR. This discovery was surprising, since up to this point it was assumed that cells and organisms are not able to survive without NIR protein [33] [11] [21]. Previous work had shown that NIR knockout in mice leads to impaired embryogenesis, resulting in the death of all mouse embryos [11] [21]. Most cell types also cannot withstand permanent NIR knockdown [21]. AML appears to be an exception to this rule. This study named „Expression pattern of Novel INHAT repressor NIR and p63 gene with protocol establishment for NIR knockdown in AML cell lines“ addresses the issue of which examined AML cells express p63 and NIR at the transcriptional and protein levels. We looked into whether NIR and p63 expression are related, as well as where this relationship is localised. The level at which any correlation is localised should be investigated. After cultivating the AML cell lines, we used standard Western immunoblots and quantitative real-time PCRs for this purpose. In addition, a protocol for the method of gymnosis using LNA-GapmeRs to induce knockdown in AML cells was to be established. This involved unassisted uptake of antisense DNA segments without transfection reagent into the cell [46]. We were able to show that, contrary to previous assumptions, the two AML cell lines HL60 and HNT34 contain cells that express neither NIR protein nor NIR transcript. Additionally, all investigated AML cell lines exhibited variable degrees of antagonistic connection between NIR and p63 expression at the transcript and protein levels, meaning that when NIR expression is strong, p63 expression is very low or absent, and vice versa. The antagonistic connection between p63 and NIR was discovered to be transcript-level localised. Furthermore, we were able to successfully establish a protocol for gymnosis using LNA-GapmeRs on the AML cell line of NB4 cells. After treatment of the AML cells for up to 7 days, the amount of NIR transcript was reduced by up to 77 %. Future studies with the question of extending the results obtained here to other AML cell lines could lead to a better understanding of the NIR protein, its role in AML and possibly to new therapeutic approaches. By establishing a protocol for inducing knockdown in AML cells, we were able to provide a tool for further investigations in this regard.