Biochemische und molekularbiologische Untersuchung der Proteine ARID1A und ARID1B in Meningeomen mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Abstract

Der Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, kurz LOH) von Chromosom 1p und 6q bei Meningeomen ist seit mehr als zwei Jahrzehnten bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass die Deletion von Chromosom 1p36 ein unabhängiger Marker für das Wiederauftreten und Fortschreiten von Meningeomen ist. ARID1A ist ein Tumorsuppressorgen auf Chromosom 1p36.11 und das resultierende Protein ARID1A ist Teil des Chromatin-regulierenden SWI/SNF-Komplexes, dessen Untereinheiten in 20 % aller Tumorentitäten mutiert sind. Diese Arbeit untersucht, ob sich Tumore mit oder ohne LOH auf Chromosom 1p in der ARID1A-Expression unterscheiden. Da aktuelle Methoden wie die Immunhistochemie nur semiquantitative Messungen erlauben, wird ein indirekter Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) für ARID1A entwickelt, dessen Validierung auf den aktuellen EMA- und FDA-Kriterien basiert. Die Auswertung zeigt, dass dieser ELISA eine objektive, genaue und präzise Quantifizierung der ARID1A-Konzentration in rekombinanten Proteinlösungen, Zellkulturstandards und Tumor-Gewebelysaten ermöglicht. So ergibt die Analyse der Standardkurven von 11 ELISA-Platten an unterschiedlichen Tagen eine Korrektheit (R2) von 0,99, die inter-assay Genauigkeit liegt bei 90,26 % und die inter-assay Präzision kann mit einem Variationskoeffizienten von 4,53 % angegeben werden. Der ELISA wird nachfolgend verwendet, um in 61 Meningeomen die ARID1A-Konzentrationen zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass Meningeome mit LOH 1p im Vergleich zu Tumoren ohne LOH 1p signifikant niedrigere ARID1A-Werte aufweisen. Neben der statistischen Signifikanz ergibt die Analyse, dass der ARID1A-Konzentrationsverlust in Tumoren mit LOH 1p im Mittel bis zu 32 % (p = 0,0172) beträgt, weshalb eine biochemische Relevanz sinnvoll erscheint. Es kann weiterhin gezeigt werden, dass Tumore mit Rezidiven und multifokalen Lokalisationen signifikant niedrigere ARID1A-Level aufweisen als solche ohne diese Merkmale (p < 0,05). Als weitere Fragestellung wird der LOH auf Chromosom 6q analysiert, der ebenfalls in höhergradigen Meningeomen gehäuft auftritt. Das auf Bande 6q25.3 gelegene Gen ARID1B könnte bei einer LOH demzufolge eine entscheidende Rolle in der Malignisierung von ARID1A-deletierten Tumoren spielen. Hierfür werden in einer Polymerase chain reac- tion (PCR) mehrere Sonden für das Chromosom 6q mit dem Fokus auf ARID1B getestet. Die detaillierte Analyse ergibt eine signifikante und starke Korrelation zwischen LOH 1p und LOH 6q bei vier Sonden (p < 0,0001), was darauf hindeutet, dass der duale Verlust der beiden SWI/SNF-Komplex Untereinheiten ARID1A und ARID1B eine treibende Rolle in der Tumorpathogenese von Meningeomen spielen könnte. Die kausale Erklärung des Effekts der LOH 1p durch einen ARID1A-Verlust ist eine wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit. Dieser kann sowohl diagnostische als auch prognostische Folgen für den Patienten haben, wobei eine gezielte Behandlungsstrategie mit PARP- und/oder ATR-Inhibitoren in Zukunft evaluiert werden könnte. Außerdem kann die dargestellte ELISA-Methode durch objektive und präzise Messungen sowie eine hohe Reproduzierbarkeit mit folglich hohem Probendurchsatz zur Bestimmung der ARID1A-Konzentration in verschiedenen Tumorentitäten verwendet werden.

Biochemical and molecular biological analysis of the proteins ARID1A and ARID1B in meningioma using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Loss of heterozygosity (LOH) of chromosome 1p and 6q in meningiomas has been known for more than two decades. Loss of chromosome 1p36 has been shown to be an independent marker for the recurrence and progression of meningiomas. ARID1A is a tumor suppressor gene on chromosome 1p36.11 and its protein ARID1A is part of the chromatin remodeling SWI/SNF complex, whose subunits are mutated in 20 % of all tumor entities. This work investigates whether tumors with or without chromosome LOH 1p differ in ARID1A expression. Since current methods such as immunohistochemistry only allow semiquantitative measurements, an indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for ARID1A is developed. Validation of this method is based on the current EMA and FDA criteria. The ELISA is shown to provide objective, accurate and precise quantification of ARID1A levels in recombinant protein solutions, cell culture standards and tumor tissue lysates. The analysis of the standard curves of 11 ELISA plates on different days results in a correctness (R2) of 0.99, the inter-assay accuracy is 90.26 % and the inter-assay precision can be stated with a coefficient of variation of 4.53 %. The ELISA was subsequently used to measure ARID1A levels in 61 meningiomas. The results show that meningiomas with LOH 1p have significantly lower ARID1A levels compared to tumors without LOH 1p. In addition to statistical significance, the analysis shows that the loss of ARID1A concentration in tumors with LOH 1p is on average up to 32% (p = 0.0172), therefore a biochemical relevance seems reasonable. Furthermore, it can also be shown that tumors with recurrences and multifocal localizations have significantly lower ARID1A levels compared to those without these features (p < 0.05). The LOH on chromosome 6q, which also occurs more frequently in higher-grade meningiomas, is analyzed, as there are indications that the ARID1B gene located on band 6q25.3 plays a decisive role in the malignization of ARID1A-deleted tumors. For this purpose, several probes for chromosome 6q with a focus on ARID1B are tested in a polymerase chain reaction (PCR). Detailed analysis reveals a significant and strong correlation between LOH 1p and LOH 6q in four probes (p < 0.0001), suggesting that the dual loss of the two SWI/SNF complex subunits ARID1A and ARID1B may play a driving role in the tumor pathogenesis of meningioma. The causal explanation of the effect from LOH 1p by ARID1A loss is a key finding of this work. This may have both diagnostic and prognostic implications for the patient, and a targeted treatment strategy for example with PARP and/or ATR inhibitors could be evaluated in the future. Furthermore, the presented ELISA method can be used to determine the ARID1A concentration in different tumor entities due to objective and precise measurements as well as high reproducibility and consequently high sample throughput.