Molekulare Determinanten der nerve/glial antigen (NG)2-Expression im juvenilen Angiofibrom und Glioblastom

Abstract

Das Proteoglykan nerve/glial antigen (NG)2 wurde erstmals auf humanen Melanomzellen beschrieben und ist heutzutage auch bekannt als human chondroitin sulfate proteogylcan 4 (CSPG4). Das 300 kDa große Typ-1-Transmembranprotein leistet über Interaktionen mit zahlreichen Proteinen, wie Integrin β1 und Kollagen, einen essenziellen Beitrag zur transmembranen Signaltransduktion. Die Expression von NG2 ist unter physiologischen Bedingungen auf bestimmte Zelltypen wie Oligodendrozyten-Progenitorzellen und Perizyten beschränkt. Hingegen wird das Proteoglykan unter pathologischen Bedingungen, wie zum Beispiel im benignen juvenilen Angiofibrom (JA) und im malignen Glioblastom (GBM), verstärkt exprimiert. Dabei fördert NG2 maßgeblich die Tumorprogression und steht entsprechend seit Jahren im Fokus der Entwicklung neuer Therapieansätze. Das JA ist ein seltener benigner Nasopharynx-Tumor, dessen Tumorexstirpation durch intraoperative Komplikationen je nach Stadium erschwert wird. In Vorarbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass die pharmakologische Inhibition der Caseinkinase (CK)2 zu einer reduzierten NG2-Expression führt. Dementsprechend könnte die Hemmung dieser Proteinkinase auch im NG2-exprimierenden JA eine neue Therapiestrategie darstellen. Daher wurde im ersten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, ob eine CK2-Inhibition im JA die NG2-Expression sowie die Zellproliferation und Zellmigration reduziert. Zu Beginn wurde die NG2- und CK2-Expression in primären JA-Gewebeproben immunhistochemisch verifiziert. Anschließend wurde in generierten JA-Zellkulturen die Expression von NG2 und CK2 mittels verschiedener molekularer Analysen nachgewiesen. Die Auswirkungen der CK2-Inhibition auf die Zellproliferation und Zellmigration wurden anhand eines water-soluble tetrazolium (WST)-1-, Bromdesoxyuridin (BrdU)- und spheroid sprouting-Assays untersucht. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Inhibition der CK2 das Zellwachstum und die migratorische Kapazität von JA-Zellen vermindert. Daher stellt die pharmakologische Hemmung der CK2 einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Behandlung des benignen JA dar. Der förderliche Effekt einer erhöhten NG2-Expression auf die GBM-Tumorprogression ist bis dato gut erforscht. Allerdings sind die zugrundliegenden genregulatorischen Mechanismen dieser dysregulierten NG2-Expression weitestgehend unbekannt. Bereits in meiner vorangegangen Masterarbeit konnte auf der Grundlage von in silico Analysen die tumorsuppressive microRNA (miR)-29b als möglicher transkriptioneller Regulator der NG2-Expression identifiziert werden. Daher wurde im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, inwiefern miR-29b die NG2-Expression reguliert. In ersten quantitativen Polymerasen-Kettenreaktionen (qPCR)-, durchflusszytometrischen und Western Blot-Analysen wurde eine miR-29b-abhängige Reduktion der NG2-Expression in GBM-Zellen detektiert. Hierbei konnte eine direkte Interaktion der miR-29b mit der NG2-untranslated region (UTR) unter Verwendung von Reportergenanalysen festgestellt werden. Neben der posttranskriptionellen Regulation von NG2 wurde zusätzlich gezeigt, dass die miR-29b über den Transkriptionsfaktor specificity protein (Sp)1 die NG2-Expression indirekt beeinflusst. Eine miRNA reguliert häufig die Expression von Proteinen mit ähnlicher zellulärer Funktion. Daher wurden als nächstes Interaktionspartner von NG2 als putative miR-29b Zielmoleküle untersucht. Detaillierte molekulare Analysen zeigten, dass die miR-29b auch die Expression der Transmembranproteine Integrin β1, platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)α und PDGFRβ in GBM-Zellen posttranskriptionell reduziert. In weiteren in vitro Untersuchungen wurde der Einfluss der miR-29b auf proliferative und migratorische Prozesse mittels WST-1, Transwell-, scratch- und spheroid sprouting-Assays analysiert. Interessanterweise zeigten die durchgeführten funktionellen Analysen, dass die miR-29b-abhängige Regulation des NG2-Netzwerks die Proliferation und Migration von GBM-Zellen reduziert. Die Untersuchungen verschiedener Signalwege ergaben, dass diese Effekte auf eine verringerte extracellular-signal regulated kinase (ERK)1/2-Aktivität zurückzuführen sind. Zusätzlich wurden die regulatorischen Mechanismen der miR-29b-Expression analysiert. Hierbei zeigte sich, dass die beiden Onkogene long non-coding (lnc)RNA H19 und c-Myc als negative Regulatoren der miR-29b im GBM fungieren und somit die NG2-Expression stimulieren. Zusammenfassend konnte im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit der regulatorische Mechanismus der NG2-Expression in Abhängigkeit der miR-29b entschlüsselt werden. Dementsprechend könnten auf Basis der miR-29b neue therapeutische Strategien zur Behandlung des NG2-positiven GBM entwickelt werden.

The proteoglycan nerve/glial antigen (NG)2 was first described on human melanoma cells and is also known as human chondroitin sulfate proteogylcan 4 (CSPG4). The 300 kDa type 1 transmembrane protein contributes significantly to transmembrane signal transduction via interactions with numerous proteins, such as integrin β1 and collagen. Under physiological conditions, the expression of NG2 is restricted to certain cell types, such as oligodendrocyte progenitor cells and pericytes. In contrast, the proteoglycan is strongly expressed under pathological conditions, such as in benign juvenile angiofibroma (JA) and malignant glioblastoma (GBM). NG2 significantly promotes tumor progression and has therefore been in the focus of the development of new therapeutic approaches for years. JA is a rare benign nasopharyngeal tumor whose tumor extirpation is often associated with intraoperative complications depending on the stage. Previous work has already shown that pharmacological inhibition of casein kinase (CK)2 leads to reduced NG2 expression. Accordingly, inhibition of this protein kinase may represent a new therapeutic strategy in NG2-expressing JA. Therefore, the first part of the present thesis investigated whether CK2 inhibition in JA reduces NG2 expression as well as cell proliferation and cell migration. Initially, NG2 and CK2 expression in primary JA tissue samples was verified by immunohistochemistry. Subsequently, the expression of NG2 and CK2 was detected in generated JA cell cultures using various molecular analyses. The effects of CK2 inhibition on cell proliferation and cell migration were investigated using water-soluble tetrazolium (WST)-1, bromodeoxyuridine (BrdU) and spheroid sprouting assay. It was found that inhibition of CK2 decreases cell growth and migratory capacity of JA cells. Therefore, pharmacological inhibition of CK2 represents a promising therapeutic approach for the treatment of benign JA. The impact of an increased NG2 expression on GBM tumor progression has been well studied to date. However, the underlying gene regulatory mechanisms of this dysregulated NG2 expression are largely unknown. In my previous master thesis, the tumor suppressive microRNA (miR)-29b has already been identified as a possible transcriptional regulator of NG2 expression based on in silico analyses. Therefore, the second part of the present thesis investigated whether miR-29b regulates NG2 expression. Initial quantitative polymerase chain reactions (qPCR), flow cytometric and Western blot analyses revealed a miR-29b-dependent reduction of NG2 expression in GBM cells. A direct interaction of miR-29b with the NG2-untranslated region (UTR) was verified using reporter gene analyses. In addition to the post-transcriptional regulation of NG2, it was also shown that miR-29b indirectly influences NG2 expression via the transcription factor specificity protein (Sp)1. A miRNA often regulates the expression of proteins with similar cellular function. Therefore, interaction partners of NG2 were investigated as potential miR-29b targets. Detailed molecular analyses revealed that miR-29b post-transcriptionally regulates also the expression of the transmembrane proteins integrin β1, platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)α and PDGFRβ in GBM cells. In additional in vitro studies, the influence of miR-29b on proliferative and migratory processes was analyzed using WST-1, transwell, scratch and spheroid sprouting assays. Interestingly, these functional analyses showed that miR-29b-dependent regulation of the NG2 network reduces the proliferation and migration of GBM cells. Investigations of different signaling pathways revealed that these effects are due to a reduced extracellular-signal regulated kinase (ERK)1/2 activity. In addition, the regulatory mechanisms of miR-29b expression were analyzed. It was found that the two oncogenes long non-coding (lnc)RNA H19 and c-Myc act as negative regulators of miR-29b in GBM and therefore stimulate NG2 expression. In summary, the regulatory mechanisms of NG2 expression in dependence of miR-29b could be determined in the second part of the present thesis. Accordingly, new therapeutic strategies for the treatment of NG2-positive GBM tumors may be developed on the basis of miR-29b.