Development of biomimetic glycosaminoglycan-gelatine hydrogel systems for the controlled delivery of pro- and anti-angiogenic factors

Abstract

The demographic change in western countries leads to an increasing number of chronic wounds which require adequate health care as age and age-associated diseases, including diabetes, are major risk factors for their development. Chronic wounds are in a state of persistent inflammation which inhibits the proliferation and angiogenesis necessary for physiological wound healing. A promising approach to improve angiogenesis in chronic wounds is the application of bioactive wound dressings mimicking the extracellular matrix and releasing pro-angiogenic factors into the surrounding tissue. Hydrogels based on collagen and derivatives of naturally occurring glycosaminoglycans, including sulphated hyaluronan (sHA), showed promising results for the delivery of pro-angiogenic factors as well as limiting their rapid degradation in vivo. Furthermore, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3 (TIMP-3) could limit the degradation of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) without significant inhibition of angiogenesis. However, the current collagen-based hydrogels are limited because of the chemical heterogeneity of collagen resulting in heterogenous hydrogel properties, whereas gelatine offers an alternative with homogenous chemical properties as well as the potential use in bioprinting. This thesis developed a biomimetic glycosaminoglycan-gelatine hydrogel system and examined it for its mechanical properties and for the controlled release of the pro-angiogenic factor VEGF-A and the inhibitor of matrix degradation TIMP-3. Hydrogels based on 10% methacrylated gelatine (GelMA) showed promising results regarding their mechanical stability and therefore were chosen to conduct further experiments. Compared to GelMA and GelMA/hyaluronan (HA) hydrogels, GelMA/sHA hydrogels showed an improved hydrogel stiffness and swelling which are necessary for a drug-delivery system. All hydrogel types were able to bind and release both VEGF-A and TIMP-3. Initially, all hydrogels bound similar amounts of VEGF-A and/or TIMP-3 but only GelMA/sHA hydrogels showed a constant release of VEGF-A and/or TIMP-3 for 21 days whereas both GelMA and GelMA/HA hydrogels rapidly released large amounts of VEGF-A and/or TIMP-3. The released VEGF-A and TIMP-3 was examined for its remaining bioactivity. VEGF-A released from GelMA/sHA hydrogels showed an increased VEGF receptor stimulation on KDR/NF AT-RE HEK293 cells compared to VEGF-A released from GelMA and GelMA/HA hydrogels. Similar results were found for TIMP-3 after release from GelMA/sHA hydrogels as it still showed inhibitory potential towards two major enzymes in extracellular matrix remodelling, collagenase and matrix metalloproteinase 9. In summary, the present thesis shows the potential of GelMA/sHA hydrogels for the controlled delivery of bioactive VEGF-A and TIMP-3 over a prolonged period. This highlights the promising potential of GelMA/sHA hydrogels as off-the-shelf bioactive wound dressings in future.

Der demographische Wandel in westlichen Ländern führt zu einer Zunahme der Zahl chronischer Wunden. Diese benötigen eine angepasste Gesundheitsversorgung, da besonders das Alter sowie altersassoziierte Erkrankungen, z. B. Diabetes mellitus, Risikofaktoren für die Entstehung von chronischen Wunden sind. Chronische Wunden befinden sich in einem Zustand der dauerhaften Entzündung, die die für die physiologische Wundheilung notwendige Proliferation und Angiogenese inhibiert. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Angiogenese in chronischen Wunden ist die Verwendung von bioaktiven Wundauflagen, die die extrazelluläre Matrix nachahmen. Hydrogele, die auf Kollagen und Glykosaminoglykanderivaten, wie zum Beispiel sulfatiertes Hyaluron (sHA), basieren, zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Freisetzung von pro-angiogenen Faktoren. Des Weiteren können bioaktive Wundauflagen pro-angiogene Faktoren in das umliegende Gewebe abgeben und den schnellen in vivo-Abbau dieser begrenzen. Weiterhin könnte der Gewebsinhibitor der Metalloproteinasen 3 (TIMP-3) den Abbau von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A (VEGF-A) einschränken ohne signifikante Inhibition der Angiogenese. Allerdings sind die aktuellen, Kollagen-basierten Hydrogele durch die heterogenen chemischen Eigenschaften des Kollagens und den daraus resultierenden heterogenen Hydrogeleigenschaften eingeschränkt. Als Alternative bietet Gelatine homogene chemische Eigenschaften und die mögliche Nutzung im Rahmen des Bioprintings. In dieser Arbeit wurde ein biomimetisches Glykosaminoglykan-Gelatine Hydrogel entwickelt und dessen mechanische Eigenschaften sowie die kontrollierte Freisetzung von dem pro-angiogenen VEGF-A und dem Inhibitor des Matrixabbaus TIMP-3 untersucht. Hydrogele basierend auf 10% methacrylierter Gelatine (GelMA) zeigten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich ihrer machanischen Stabilität, sodass mit diesen weitere Experimente durchgeführt wurden. GelMA/sHA Hydrogele zeigten verbesserte Steifheit und Schwellung verglichen mit GelMA und GelMA/Hyaluron (HA) Hydrogelen. Dabei handelt es sich um notwendige Eigenschaften für sog. „drug-delivery“-Systeme. Alle Hydrogelarten waren in der Lage VEGF-A sowie TIMP-3 zu binden und freizusetzen. Initial banden alle Hydrogele ähnliche Mengen an VEGF-A und/oder TIMP-3, aber nur GelMA/sHA Hydrogele zeigten eine konstante Freisetzung von VEGF-A und/oder TIMP-3 über 21 Tage, wohingegen die Freisetzung aus GelMA und GelMA/HA Hydrogelen schnell große Mengen an VEGF-A und/oder TIMP-3 freisetzten. Die verbleibende biologische Aktivität von freigesetztem VEGF-A und TIMP-3 wurde untersucht. VEGF-A zeigte nach seiner Freisetzung aus GelMA/sHA Hydrogelen, im Vergleich zu GelMA und GelMA/HA Hydrogelen, eine verstärkte Aktivierung des VEGF-Rezeptors von KDR/NF AT-RE HEK293 Zellen. Ähnliche Ergebnisse fanden sich für TIMP-3 nach der Freisetzung aus GelMA/sHA Hydrogelen. TIMP-3 zeigte weiterhin eine inhibierende Wirkung gegenüber zwei wichtigen Enzymen des Remodellings der extrazellulären Matrix, Kollagenase und Matrixmetalloprotease 9. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit das Potential von GelMA/sHA Hydrogelen zur kontrollierten Freisetzung von bioaktivem VEGF-A und TIMP-3 über längere Zeit. GelMA/sHA Hydrogele haben das Potential zukünftig als bioaktive „off-the-shelf“-Wundauflagen angewandt zu werden.