Bidirektionale Kommunikation von Eukaryoten und Prokaryoten über extrazelluläre Vesikel

Abstract

Extrazelluläre Vesikel sind kleine Lipid-Membranpartikel, die von Pro- und Eukaryoten in den extrazellulären Raum sezerniert werden und eine Reihe von verschiedenen Molekülen wie Proteine, Lipide aber auch Nukleinsäuren wie etwa RNA transportieren können (Yáñez-Mó et al., 2015). In den vergangenen Jahren konnte gezeigt werden, dass extrazelluläre Vesikel eine wichtige Funktion bei der Cross-Kingdom Kommunikation zwischen Bakterien und humanen Zellen ausüben. Insbesondere hat dabei die Rolle der mit den extrazellulären Vesikeln assoziierten RNAs sowie der Zusammenhang mit der Entstehung und Progression von verschiedenen Erkrankungen immer weiter an Interesse gewonnen (Amatya et al., 2021; Iyaswamy et al., 2023; Munhoz da Rocha et al., 2020; Q. Shen et al., 2022). Morbus Parkinson ist eine der häufigsten neurodegenerative Erkrankung der Welt (Poewe et al., 2017). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass bei Parkinson-Patienten Veränderungen in der Zusammensetzung des Darmmikrobioms auftreten (Hill-Burns et al., 2017; Hopfner et al., 2017; A. Lin et al., 2018). Kürzlich konnte zudem nachgewiesen werden, dass diese Veränderungen im Zusammenhang mit bei Parkinson-Patienten häufig auftretenden Obstipationen stehen (Fu et al., 2022), welche zum Teil Jahre vor der Diagnose der Erkrankung in Erscheinung treten können (Adams-Carr et al., 2016; Noyce et al., 2012; Svensson et al., 2016). In den vergangenen Jahren wurde daher vermehrt der Gastrointestinaltrakt als Ursprung von M. Parkinson diskutiert (Breen et al., 2019; Houser & Tansey, 2017; Lionnet et al., 2018). Voraussetzung für den Einfluss des Darmmikrobioms auf die Pathogenese von Morbus Parkinson ist jedoch eine wechselseitige Kommunikation den Bakterien auf der einen und den Darmepithelzellen auf der anderen Seite. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand somit darin die Kommunikation von Bakterien, bei denen eine Verbindung zu Morbus Parkinson besteht, und humanen intestinalen Epithelzellen über extrazelluläre Vesikel zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Zusammensetzung des Darmmikrobioms von Parkinson-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollprobanden untersucht, um Bakterienfamilien und -spezies mit veränderter Häufigkeit zu identifizieren. Im Folgenden wurden die Bakterien Lacticaseibacillus casei, Enterococcus faecalis und Proteus mirabilis exemplarisch ausgewählt und deren extrazelluläre Vesikel näher charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass alle untersuchten Bakterien in unterschiedlichem Maße extrazelluläre Vesikel sezernieren und diese sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig von humanen Darmepithelzellen aufgenommen werden, wobei die extrazellulären Vesikel von Enterococcus faecalis und Proteus mirabilis deutlich schneller internalisiert wurden als die von Lacticaseibacillus casei. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass alle bakteriellen extrazellulären Vesikel unterschiedliche RNA-Fragmente transportieren, wobei der größte Anteil kleine RNAs mit einer Länge unter 200 Nukleotiden waren. Die Analyse des Transkriptoms der Darmepithelzellen zeigte, dass sowohl die bakteriellen extrazellulären Vesikel als auch die damit assoziierte RNA selbst zu spezifischen Veränderungen in der Genexpression unter anderem von Zytokinen und Chemokinen führen kann. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die durch die extrazellulären Vesikel von Proteus mirabilis hervorgerufenen Effekte nicht alleine durch die in den extrazellulären Vesikeln enthaltenen Lipopolysaccharide erklärt werden konnten. Um die Kommunikation der humanen Zellen mit Bakterien näher analysieren zu können, wurden die bereits untersuchten Bakterienspezies mit extrazellulären Vesikeln, welche von Darmepithelzellen sezerniert wurden, inkubiert. Dabei zeigte sich, dass vor allem Enterococcus faecalis dazu in der Lage war, eukaryotische extrazelluläre Vesikel zu internalisieren, wodurch das Wachstum der Bakterien beeinflusst werden konnte. Mit Hilfe einer smallRNA-Sequenzierung konnten anschließend microRNAs, unter anderem die miR 192-5p, identifiziert werden, die in extrazellulären Vesikel von Darmepithelzellen sezerniert wurden. Weitere Analysen haben gezeigt, dass Proteus mirabilis im Gegensatz zu den anderen beiden Bakterien dazu in der Lage war, die humane miR-192-5p zu internalisieren. Durch die Verpackung der miRNA in artifizielle Liposomen konnte die Aufnahme in Lacticaseibacillus casei und Enterococcus faecalis jedoch deutlich gesteigert werden. Zusammenfassend konnten die Ergebnisse dieser Arbeit die individuellen Auswirkungen der verschiedenen bakteriellen extrazellulären Vesikel sowie der damit assoziierten RNA bei der Kommunikation mit humanen Darmepithelzellen zeigen. Darüber hinaus liefern die Untersuchungen Einblicke in die Fähigkeit von eukaryotischen Zellen mit Bakterien über humane microRNAs zu kommunizieren. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen somit dazu beitragen die bidirektionale Kommunikation zwischen Pro- und Eukaryoten im Rahmen von verschiedenen Erkrankungen besser zu verstehen.

Extracellular vesicles are small membrane particles that can be secreted by prokaryotes and eukaryotes into the extracellular space. Their cargo can include a variety of different molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids like RNA (Yáñez-Mó et al., 2015). Recently, it has been demonstrated that extracellular vesicles play a critical role in cross-kingdom communication between bacteria and human cells. In this context, the role of EV-associated RNAs and their connection to the development and progression of various diseases have gained increasing interest (Amatya et al., 2021; Iyaswamy et al., 2023; Munhoz da Rocha et al., 2020; Q. Shen et al., 2022). Parkinson's disease is one of the most common neurodegenerative diseases in the world (Poewe et al., 2017). Numerous studies have demonstrated changes in the composition of the gut microbiome in Parkinson's patients (Hill-Burns et al., 2017; Hopfner et al., 2017; A. Lin et al., 2018). Recent findings suggest that these alterations are associated with constipation, a common symptom in Parkinson’s patients (Fu et al., 2022), which can manifest years for the diagnosis of the disease (Adams-Carr et al., 2016; Noyce et al., 2012; Svensson et al., 2016). In the past years, the gastrointestinal tract has therefore increasingly been discussed as a potential origin of Parkinson’s disease (Breen et al., 2019; Houser & Tansey, 2017; Lionnet et al., 2018). However, a prerequisite for the influence of the gut microbiome on the pathogenesis of Parkinson's disease is the bidirectional communication between bacteria on one side and intestinal epithelial cells on the other. Hence, the aim of this thesis was to investigate the communication between bacteria associated with Parkinson's disease and human intestinal epithelial cells via extracellular vesicles. At first, the composition of the gut microbiome in Parkinson’s patients was compared to that of healthy controls to identify bacterial families and species with altered abundances. Subsequently, the bacteria Lacticaseibacillus casei, Enterococcus faecalis, and Proteus mirabilis were selected for further characterization of their extracellular vesicles. It was found that all examined bacteria secrete extracellular vesicles to varying degrees, which were taken up by human intestinal epithelial cells in a time- and concentration-dependent manner. Notably, extracellular vesicles from Enterococcus faecalis and Proteus mirabilis were internalized significantly faster than those from Lacticaseibacillus casei. Furthermore, it was shown that all bacterial extracellular vesicles transport various RNA fragments, with a majority of these RNAs being smallRNAs with a length under 200 nucleotides. Transcriptome analysis of intestinal epithelial cells revealed that both bacterial extracellular vesicles and associated RNA itself can lead to specific changes in the expression of genes, including those encoding for cytokines and chemokines. Moreover, it was shown that the effects caused by extracellular vesicles from Proteus mirabilis were not exclusively caused by lipopolysaccharides contained in these vesicles. To further analyze the communication between human cells and bacteria, the previously studied bacterial species were incubated with extracellular vesicles secreted from intestinal epithelial cells. It has been observed that especially Enterococcus faecalis could internalize eukaryotic extracellular vesicles, which subsequently influenced the bacterial growth. Using smallRNA sequencing, microRNAs including miR-192-5p have been identified, which were secreted in extracellular vesicles from intestinal epithelial cells. Further analyses demonstrated that, unlike the other two bacteria, Proteus mirabilis was able to internalize human miR-192-5p. However, packaging of the microRNA into artificial liposomes significantly increased the uptake in Lacticaseibacillus casei and Enterococcus faecalis. In summary, the findings of this thesis highlight the individual effects of bacterial extracellular vesicles and their associated RNAs in communication with human intestinal epithelial cells. Furthermore, the results provide insights into the ability of eukaryotic cells to communicate with bacteria via human microRNAs. These findings aim to enhance the understanding of bidirectional communication between prokaryotes and eukaryotes in the context of various diseases.