Ca2+-entry into Red Blood Cells: Channel Mediated Influx and its Detection

Abstract

Blood is an essential connective tissue that performs several critical functions in the human body. Red blood cells (RBCs), constituting around 45% of the blood volume, are responsible for gas exchange and nutrient transport. Mature RBCs have a unique biconcave shape and are filled with hemoglobin (Hb), but they lack a nucleus and organelles. Because of their structure, RBCs rely on ion regulation as one of the key factors influencing cell behavior. Ion transport across RBC membranes occurs through a combination of passive channels, transporters and active pumps. Ca2+, as a universal signalling molecule, plays an essential role in RBCs to regulate cellular activities. Due to the large gradient across the membrane, a small number of channel openings can lead to acute and severe changes in free Ca2+ levels. The plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA) is one of the key factors in maintaining the Ca2+ gradient in RBCs. In addition, several channels have been identified as sources of Ca2+ entry in erythrocytes, including Piezo 1, transient receptor potential vanilloid type 2 (TRPV2) and Cav2.1 channels. Piezo 1 channels, which are sensitive to mechanical stimuli, help regulate RBC volume and contribute to RBC deformability. TRPV2 and Cav2.1 channels in RBCs support RBC adaptability under physiological and pathological conditions. When the intracellular free Ca2+ concentration changes, it can trigger several downstream pathways to regulate cell behavior. For example, the Gárdos channel regulates K+ efflux in response to Ca2+ levels, affecting cell volume and shape. To understand the Ca2+-related pathways in RBCs, it is important to quantify the Ca2+ concentration in RBCs under different conditions. However, current methods based on fluorescence intensity can only provide semi-quantification, because of a strong influentially by the hemoglobin. Fluorescence lifetime is one of the intrinsic properties of fluorophores that is independent on fluorophore concentration, initial disturbance conditions and fluorescence intensity. The characteristics of fluorescence lifetime provide a potential method for the quantification of Ca2+. This study outlines the methods for studying RBCs under different experimental conditions. Blood samples from different sources, including healthy individuals, marijuana smokers and patients with specific diseases, were processed to isolate RBCs. Isolated RBCs were subjected to further steps for Ca2+ measurement based on fluorescence intensity. Immunofluorescence and western blot techniques were used to detect and quantify specific proteins within the RBC samples. In addition, the Ca2+ indicator-loaded RBCs were imaged using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). The data presented in the results part shows that an activation of the Piezo 1 channel caused by the application of Yoda 1, one of Piezo 1 activators, leads to an increase of intracellular Ca2+ in two phases, which can be regulated by multiple factors. Measurements of RBCs from people with spectrin mutation or thalassemia β mutation provide evidence that membrane and cytoskeletal structure may influence Piezo 1 channel function, causing a different Yoda 1-induced intracellular Ca2+ increase. PMCA show strong inhibitory effects on the first phase of Yoda 1-induced Ca2+ increase. Cl− conductance has a positive influence on Yoda 1-induced Ca2+ entry and maintenance of high free Ca2+ levels. However, the pathway involved is still unknown. The Gárdos channel not only induces K+ efflux and hyperpolarization in response to a Yoda 1-induced Ca2+ increase, its opening probability can also influence the Cav2.1 channel activity involved in Yoda 1-induced Ca2+-entry. TRPV2 is a non-selective cation channel recently discovered in RBCs. RBCs show a heterogeneous response to activation of TRPV2 with an increase of free Ca2+ concentration. In marijuana consumers and sickle cell patients, after application of Δ9- Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), a TRPV2 activator, RBCs have a higher induced Ca2+ concentration, a higher number of responding RBCs, and even hyperpolarization. It is indicating that these RBCs are more sensitive to Δ9-THC. Sickle RBCs have an enhanced response to Δ9-THC in the deoxygenated condition. This suggests that oxidative stress may alter the activity of the channels. In addition, the studies of patient RBCs also suggest that the cell age may influence channel activity and sensitivity. The analysis of FLIM images of X-Rhod-1-loaded RBCs with low or high intracellular Ca2+ shows different lifetimes with the lowest fluorescence signal originating in the RBC itself. The number of fitted lifetime components is different between 1-photon excitation and 2-photon excitation. The environment and the concentration of Hb in RBCs can influence the lifetime components and the amplitude-averaged lifetime of XRhod- 1. Other factors such as excitation wavelength, acquisition time, use of CellTak and Ca2+-ionophore Bromo-A23187 show no effect on the lifetime parameters of X-Rhod-1. With the chosen measurement parameters, the normalized amplitude-average lifetime is a promising parameter to be used to establish a calibration curve for Ca2+quantification.

Blut ist ein wichtiges flüssiges Bindegewebe, das im menschlichen Körper mehrere wichtige Funktionen erfüllt. Die roten Blutzellen (Erythrozyten), die etwa 45% des Blutvolumens ausmachen, sind für den Gasaustausch und den Nährstofftransport verantwortlich. Vollständig ausgebildete Erythrozyten haben eine einzigartige bikonkave Form und sind mit Hämoglobin (Hb) gefüllt, besitzen jedoch keinen Zellkern und keine Organellen. Aufgrund dieser Struktur sind die Erythrozyten auf die Ionenregulierung als einen der Schlüsselfaktoren zur Steuerung des Zellverhaltens angewiesen. Der Ionentransport durch die Erythrozytenmembranen erfolgt durch eine Kombination aus passiven Transporteren, Kanälen und aktiven Pumpen. Ca2+ als universelles Signalmolekül spielt in Erythrozyten eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der zellulären Aktivitäten. Aufgrund des großen Gradienten über die Membran kann bereits eine kleine Anzahl von Kanalöffnungen zu akuten und signifikanten Veränderungen der freien Ca2+-Konzentration führen. Die Plasmamembran-Kalzium- ATPase (engl. PMCA) ist einer der wichtigsten Faktoren für die Aufrechterhaltung des Ca2+-Gradienten in Erythrozyten. Darüber hinaus wurden in der Vergangenheit mehrere Kanäle als Quellen für den Ca2+-Eintritt in Erythrozyten identifiziert, darunter Piezo 1, der Transient-Receptor-Potential-Vanilloid-Kanal Typ 2 (TRPV2) und Cav2.1- Kanäle. Piezo 1-Kanäle, die empfindlich auf mechanische Reize reagieren, helfen bei der Regulierung des Volumens der Erythrozyten und tragen zur Verformbarkeit der Erythrozyten bei. TRPV2 und Cav2.1 in Erythrozyten vermitteln zelluläre Reaktionen auf mechanische und thermische Belastungen und unterstützen so ihre Anpassungsfähigkeit unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Wenn sich die intrazelluläre freie Ca2+-Konzentration ändert, kann dies verschiedene nachgeschaltete Signalwege zur Regulierung des Zellverhaltens auslösen. So reguliert der Gárdos-Kanal beispielsweise den K+-Efflux als Reaktion auf den Ca2+-Spiegel und beeinflusst folglich auch das Zellvolumen und die Zellform. Um die Ca2+-abhängigen Signalwege in Erythrozyten zu verstehen, ist es wichtig, die Ca2+-Konzentration im Zellinnern unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Die derzeitigen Methoden, die auf der Fluoreszenzintensitätsmessungen basieren, können jedoch nur eine Semiquantifizierung liefern, da die Messungen durch das Hämoglobin stark beeinflusst werden. Die Fluoreszenzlebensdauer ist eine der intrinsischen Eigenschaften von Fluorophoren, die unabhängig von deren Konzentration, anfänglichen Störungsbedingungen und der Fluoreszenzintensität ist. Die Eigenschaften der Fluoreszenzlebensdauer bieten ein potentielles Maß zur Quantifizierung der Ca2+-Konzentration. In dieser Studie werden die Methoden zur Untersuchung von Erythrozyten unter verschiedenen Versuchsbedingungen beschrieben. Blutproben unterschiedlichen Ursprungs, darunter gesunde Personen, Marihuana-Raucher und Patienten mit bestimmten Krankheiten, wurden zur Isolierung der Erythrozyten aufbereitet. Die isolierten Erythrozyten wurden weiteren Schritten zur Kalziummessung anhand der Fluoreszenzintensität unterzogen. Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Techniken wurden eingesetzt, um spezifische Proteine in den Erythrozytenproben nachzuweisen und zu quantifizieren. Darüber hinaus wurden die mit Ca2+-Indikatoren beladenen Erythrozyten mittels Fluoreszenzlebensdauer- Mikroskopie (engl. FLIM) abgebildet. Die im folgenden Kapitel vorgestellten Daten zeigen, dass die Aktivierung des Piezo 1- Kanals durch den Piezo 1-Aktivator Yoda 1 zu einem zweiphasigen intrazellulären Ca2+- Anstieg führen kann, der durch mehrere Faktoren gesteuert werden kann. Untersuchungen an Erythrozyten von Menschen mit einer Spektrin- oder einer Beta-Thalassämie-Mutation liefern Beweise dafür, dass die Membran- und Zytoskelettstruktur die Funktion des Kanals Piezo 1 beeinflussen kann. Dies hat unterschiedliche Yoda 1-induzierte intrazelluläre Ca2+- Anstiege zur Folge. Die PMCA zeigt starke hemmende Effekte auf die erste Phase des Yoda 1-induzierten Ca2+-Anstiegs. Die Cl−-Leitfähigkeit hat einen positiven Einfluss auf den Yoda 1-induzierten Ca2+-Anstieg und die Aufrechterhaltung eines hohen freien Ca2+- Spiegels. Der beteiligte Signalweg ist jedoch noch unbekannt. Der Gárdos-Kanal induziert nicht nur den K+-Efflux und die Hyperpolarisation als Reaktion auf den Yoda 1-induzierten Ca2+-Anstieg, sondern seine Öffnungswahrscheinlichkeit kann auch die Aktivierung des Cav2.1-Kanals beeinflussen, der am Yoda 1-induzierten Ca2+-Anstieg beteiligt ist. TRPV2 ist ein kürzlich in roten Blutzellen entdeckter nicht-selektiver Kationenkanal. Erythrozyten zeigen eine heterogene Reaktion auf die Aktivierung von TRPV2 durch eine erhöhte freie Ca2+-Konzentration. Nach Zugabe von Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), einem TRPV2-Aktivator, wiesen die Erythrozyten von Marihuana-Konsumenten und Sichelzellpatienten eine höhere induzierte Ca2+-Konzentration, eine höhere Anzahl reagierender Erythrozyten und sogar eine Hyperpolarisation auf. Dies deutet darauf hin, dass diese Erythrozyten empfindlicher auf Δ9-THC reagieren. Außerdem reagieren sichelförmigen Erythrozyten im desoxygenierten Zustand verstärkt auf Δ9-THC. Somit gibt es Hinweise, dass oxidativer Stress die Aktivität der Kanäle verändern kann. Darüber hinaus legen die Studien mit Erythrozyten von Patienten nahe, dass das Alter der Erythrozyten die Aktivität und Empfindlichkeit der Kanäle beeinflussen kann. Die Analyse der FLIM-Bilder von mit X-Rhod-1 gefärbten Erythrozyten mit niedrigem oder hohem intrazellulärem Ca2+ zeigt unterschiedliche Lebensdauern, wobei das Fluoreszenzsignal geringster Intensität von den Erythrozyten selbst ausgeht. Die Anzahl der per Regression angepasster Lebensdauerkomponenten ist zwischen 1-Photonen-Anregung und 2-Photonen-Anregung unterschiedlich. Eine unzureichende Fokussierung während der Ablichtung kann die Auflösung der Anzahl der angepassten Lebenszeitkomponenten beeinflussen. Auch die Umgebung und die Hb-Konzentration in den Erythrozyten können die Lebenszeitkomponenten und die amplitudengemittelte Lebensdauer von X-Rhod-1 beeinflussen. Andere Faktoren wie Anregungswellenlänge, Aufnahmezeit und die Verwendung verschiedener Farbstoffe wie CellTak und Ca2+-Ionophor Bromo-A23187 haben keinen Einfluss auf die Lebenszeitparameter von X-Rhod-1. Mit den im Zuge dieser Analyse bestimmten Messparametern ist die normalisierte amplitudengemittelte Lebensdauer ein vielversprechender Parameter, der zur Erstellung einer Kalibrierungskurve für die Ca2+-Quantifizierung verwendet werden kann.