The journey of murine CD8-positive T lymphocytes-derived exosomes from the cells via the organelles to the target

Abstract

Abstract Exosomes are small extracellular vesicles (30-150 nm) secreted by virtually all cell types. Exosomes play a pivotal role in intercellular communication through the transfer of bioactive molecules, including proteins, lipids, and RNAs. Despite their significance in immune modulation and tumor suppression, the mechanisms underlying their biogenesis and release from cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and their function in the immune system are poorly understood. CTLs are essential for adaptive immunity, in which their cytotoxic machinery is used to target infected or malignant cells. In this study, we have characterized exosomes derived from murine CTLs and investigated their secretion dynamics and functional properties. We show that CTL-derived exosomes are packaged in two distinct types of organelles: multivesicular bodies (MVBs) and multicore granules (MCGs). Using structured illumination microscopy (SIM) and correlative light and electron microscopy (CLEM), we identified CD81 as a more specific marker for CTL exosomes than the currently used marker, CD63, which also marks single-core granules (SCGs). Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) studies revealed polarized secretion of MCG-derived exosomes at the immune synapse, while MVB-derived exosomes were released in a non-polarized manner. Notably, MCG secretion was MUNC13-4-dependent, contrasting with the MUNC13 4 independent secretion of MVBs. Furthermore, SNARE profiling revealed VAMP7 specificity to MVBs, distinguishing them from MCGs and SCGs. Isolated CTL-derived exosomes displayed heterogeneity in size and surface markers, as shown by sucrose density gradient centrifugation, transmission electron microscopy (TEM), and immune labeling. Using a 10X expansion method, we identified two exosome subpopulations based on tetraspanin expression: smaller CD81-positive exosomes and larger CD63-positive ones. Functional assays demonstrated that wild-type CTL-derived exosomes efficiently induced caspase-3-mediated apoptosis in target cells, while MUNC13-4 knockout CTLs, deficient in MCG-mediated exosome secretion, showed reduced cytotoxic efficacy. These findings elucidate the regulated biogenesis and secretion of CTL-derived exosomes and their distinct roles in cytotoxicity, providing new insights into immune regulation. By highlighting exosome heterogeneity and their potential in cancer immunotherapy, this work lays the foundation for leveraging CTL-derived exosomes as novel therapeutic agents.

Zusammenfassung Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel (30-150 nm), die von nahezu allen Zelltypen sezerniert werden. Exosomen spielen eine entscheidende Rolle in der interzellulären Kommunikation durch den Transfer von bioaktiven Molekülen, einschließlich Proteinen, Lipiden und RNAs. Trotz ihrer Bedeutung in der Immunmodulation und Tumorsuppression sind die Mechanismen, die ihrer Biogenese und Freisetzung aus zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) zugrunde liegen, sowie ihre Funktion im Immunsystem noch wenig verstanden. CTLs sind für die adaptive Immunität essenziell, wobei ihre zytotoxische Maschinerie eingesetzt wird, um infizierte oder maligne Zellen anzugreifen. In dieser Studie haben wir Exosomen aus murinen CTLs charakterisiert und ihre Sekretionsdynamik sowie funktionelle Eigenschaften untersucht. Wir zeigen, dass CTL-abgeleitete Exosomen in zwei verschiedene Arten von Organellen verpackt sind: multivesikuläre Körper (MVBs) und Multikerngranula (MCGs). Mithilfe der strukturierten Beleuchtungmikroskopie (SIM) und korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) identifizierten wir CD81 als spezifischeren Marker für CTL-Exosomen im Vergleich zum derzeit verwendeten Marker CD63, der auch Einzelkerngranula (SCGs) markiert. Studien mit totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) zeigten eine polarisierte Sekretion von MCG-abgeleiteten Exosomen an der Immunsynapse, während MVB-abgeleitete Exosomen auf nicht-polarisierte Weise freigesetzt wurden. Bemerkenswerterweise war die MCG-Fusion MUNC13-4-abhängig, im Gegensatz zur MUNC13-4-unabhängigen Fusion von MVBs. Darüber hinaus ergab das SNARE-Profiling eine VAMP7-Spezifität für MVBs, die diese von MCGs und SCGs unterscheidet. Isolierte CTL-abgeleitete Exosome zeigten eine Heterogenität in Größe und Oberflächenmarkern, wie durch Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunfärbung gezeigt wurde. Mit einer 10X-Expansionsmethode identifizierten wir zwei Exosomen-Subpopulationen basierend auf der Tetraspanin-Expression: kleinere CD81-positive Exosomen und größere CD63-positive Exosomen. Funktionelle Assays zeigten, dass Wildtyp-CTL-abgeleitete Exosomen effizient die Caspase-3-vermittelte Apoptose in Zielzellen induzierten, während MUNC13-4-Knockout-CTLs, die in der MCG-vermittelten Exosomen-Sekretion defizient waren, eine reduzierte zytotoxische Effizienz aufwiesen. Diese Ergebnisse erhellen die regulierte Biogenese und Sekretion von CTL-abgeleiteten Exosomen und ihre unterschiedlichen Rollen in der Zytotoxizität, was neue Einblicke in die Immunregulation bietet. Durch die Hervorhebung der Heterogenität von Exosomen und ihrem Potenzial in der Krebsimmuntherapie legt diese Arbeit die Grundlage für die Nutzung von CTL-abgeleiteten Exosomen als neuartige therapeutische Agenzien.