Heterologous expression and genetic engineering of natural product biosynthetic pathways

Abstract

The misuse and overuse of antibiotics, combined with the ability of bacteria to adapt and develop resistance, have led to more and more cases of infections that are very hard or even impossible to treat. Multi-resistant pathogens are already a serious threat to human health today, and their growing numbers worldwide are alarming. To address this crisis, the discovery of new antibacterial compounds and their optimisation into clinical candidates are of crucial importance. This thesis focuses on the antibiotic darobactin, which represents a promising novel class of antibiotics, effective against Gram-negative pathogens. The work describes the generation of novel darobactin derivatives, some of which demonstrate improved bioactivity, such as, the lead candidate D22 showing promising efficacy in in vitro and in vivo models. In addition, structural limits of the biosynthetic production method were explored. However, a key challenge remains: overcoming production limitations in the heterologous host Escherichia coli. To address this, the thesis investigates alternative production systems, including Gram-positive and an eukaryotic host, as potential solutions. Additionally, efforts to identify the previously unknown peptidase involved in darobactin's maturation process are described, which could pave the way for enhancing its production efficiency.

Der unsachgemäße und übermäßige Einsatz von Antibiotika sowie die Fähigkeit von Bakterien, sich anzupassen und Resistenzen zu entwickeln, haben zu immer mehr Infektionen geführt, die schwer oder sogar unmöglich zu behandeln sind. Multiresistente Erreger stellen bereits heute eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und ihre weltweite Zunahme ist alarmierend. Um diese Krise zu bewältigen, ist die Entdeckung neuer antibakterieller Wirkstoffe und deren Entwicklung zu klinischen Kandidaten entscheidend. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das Antibiotikum Darobactin, eine vielversprechende neue Wirkstoffklasse gegen Gram-negative Erreger. Es wird die Herstellung neuartiger Darobactin-Derivate beschrieben, von denen einige verbesserte Bioaktivität zeigen, darunter der Spitzenkandidat D22, der vielversprechende Wirksamkeit in in vitro- und in vivo-Modellen zeigt. Zudem wurden die strukturellen Grenzen der biosynthetischen Produktionsmethode untersucht. Eine zentrale Herausforderung bleibt jedoch die Überwindung der Produktionslimitierungen im heterologen Wirt Escherichia coli. Zur Lösung dieses Problems werden alternative Produktionssysteme, darunter Gram-positive und ein eukaryotischer Wirt, als potenzielle Ansätze untersucht. Zusätzlich werden Strategien zur Identifizierung der bislang unbekannten Peptidase beschrieben, die an der Reifung von Darobactin beteiligt ist und deren Entschlüsselung zur Produktionsoptimierung beitragen könnte.