The Effects of Tobacco and Cannabis Consuming on Male Fertility: A Comprehensive Analysis of Sperm Quality, Chromatin integrity, Genetic Variations, and Oxidative Stress

Abstract

Recent comprehensive meta-analysis research has uncovered a notable reduction in sperm concentration and total sperm counts among men from North America, Europe, and Australia between 1973 and 2011. This decline, estimated at 50–60%, affects men regardless of their fertility status, with no signs of stabilization in recent years. These findings strongly suggest a significant deterioration in male reproductive health, with implications that extend beyond fertility concerns (Levine H et al., 2017). Given the magnitude of this global shift, the most compelling explanation is one that universally affects all populations involved. There is no doubt about the significant impact that new lifestyle changes can have on us. It is well-documented that tobacco smoking adversely affects a broad spectrum of physiological functions. Additionally, the use of tobacco and cannabis presents an escalating threat to male reproductive health. Although the prevalence of tobacco smoking declined over time among men in reproductive age, the use of other inhaled products, such as cannabis have increased. Therefore, understanding their potential deleterious effects on male fertility is crucial for the well-being of future generations. Numerous studies over recent decades have indicated a correlation between smoking tobacco or cannabis and a decline in sperm quality, potentially leading to male infertility. Tobacco smoking, a widespread global occurrence, considerably impacts not only an individual's well-being but also their genetic makeup. Over the past few years, comprehensive research has explored the intricate relationship between tobacco exposure and the expression of numerous genes. Recently cannabis consuming has shifted following the legislation of marijuana in various countries and states, an imperative public health concern has emerged that affect not only to users but also to their offspring. The perception of Cannabis toxicity and safety in society, politics, and even scientific circles has changed dramatically in recent decade. Consequently, a few questions have been raised regarding the effects of marijuana (Cannabis sativa) on human physiology and reproductive health in the short and long term. Therefore, the purpose of this study was to determine the effects of tobacco and cannabis use on sperm quality, chromatin integrity, and oxidative damage among men Previously engaged in annual use of tobacco or cannabis. And to investigate, nonetheless, the damage that tobacco and cannabis and their constituents on sperm mitochondrial genetic variants in the Cytochrome C Oxidase 1, 2 and 3 genes (MT-CO1, MT-CO2, and MT-CO3). Specifically on the alterations in the cytochrome oxidase encoded gene present within sperm mitochondria. Initially, 10 semen samples have undergone an in Vitro study by analyzing semen parameters (volume, sperm count, motility), within 1 hour after collection, according to WHO criteria 2020. For accurate results, Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system was used to determine sperm parameters. Each sample was exposed to 1 mL; 10 µg/mL of THC, THC-COOH, and CBD dissolved in methanol. All samples were also exposed to 1 mL pure methanol as a control group to eliminate the potential effects of methanol on sperm cells. Several smears (10 µL) of each sample were taken in order to assess the functionality of sperm’s chromatin integrity by employing a Chromomycin (CMA3) and DNA fragmentation (Acridine Orange) assays. Then, a total of 116 samples were collected from men aged less than 40 years at Prince Rashid Bin Al Hassan Hospital (PRBH) in Irbid, Jordan. The samples were divided into three groups: Group 1 - Non-smokers (control group, n=38), Group 2 (n=39), - Tobacco heavy smokers, more than 10 cigarettes a day for at least 5 years, and Group 3 - Cannabis smokers (n=37) with at least 4 joints in a week for more than 3 years. Chromatin integrity and DNA damage was assessed by using Chromomycine CMA₃ and Acridine Orange staining. The 8-OHG RNA assay was employed to measure oxidative damage. Besides, the whole genome of spermatozoa was extracted using a QIAamp DNA Mini Kit and the mitochondrial DNA was amplified by using the REPLI-g Mitochondrial DNA Kit. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the MT-CO1, MT-CO2 and MT-CO3 gene. Then, samples were purified and sequenced using the Sanger method. The treatment of sperm cells with 10µL of THC, THC-COOH, and CBD resulted in a significant decline in total sperm motility upon exposure to THC and CBD (P ≤ 0.001 and P ≤ 0.003, respectively). Progressive motility was notably reduced (P ≤ 0.001), and the average number of immotile sperm significantly increased (P ≤ 0.003) following incubation with THC and CBD, respectively. However, only a slight reduction in total sperm motility was observed after incubation with THC-COOH.

In vivo, in the other hand, sperm count, and progressive motility showed no significant difference between the investigated groups (non-smokers, tobacco smokers, and cannabis smokers). However, the mean value of immotile spermatozoa and morphologically abnormal spermatozoa increased among smokers and cannabis smokers compared to non-smokers (58,92 % for Tobacco smokers, 68,66 % for cannabis smokers and 51,73 % for non-smokers). (5.02 for tobacco smokers, 2.26 for cannabis smokers and 7.46 for non-smokers). In addition, the mean value of chromatin condensation of spermatozoa showed a statistically significant difference among non-smokers (15 % ± 15.4), tobacco smokers (25.3 % ± 14.9; P ≤ .001), and cannabis smokers (37,13 % ± 20.1; P ≤ .001). A cumulative sum of 22 single nucleotide polymorphisms (SNPs) was detected in the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (Mt-Co1) gene, with a distribution of 37,8 %, 64,1 %, and 54 % among non-smoker, tobacco smoker, and cannabis smoker groups, respectively. On the other hand, 17 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) have been identified within the mitochondrial-encoded Cytochrome C Oxidase II (MT-CO2) gene, with a proportion of 21,62 %, 28,2 %, and 43,24 % among non-smoker, tobacco smoker, and cannabis smoker groups, respectively. In the mitochondrial-encoded cytochrome c oxidase III gene (Mt-Co3), a total of 20 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with a distribution of 54,05 %, 64,1 %, and 51,35 % among the investigated groups - non-smokers, tobacco smokers, and cannabis smokers, respectively. Nevertheless, none of these SNPs were significantly different between the three groups. This study demonstrates that tobacco and cannabis smoking have a negative effect on sperm parameters, chromatin condensation (Sperm maturity) and DNA integrity of spermatozoa and should be avoided in men of reproductive age. It highlights the importance as well of promoting education and awareness regarding cannabis use and its extensive implications, affecting not only individual health but also the well-being of future generations.

Jüngste umfassende Meta-Analysen haben eine bemerkenswerte Reduktion der Spermienkonzentration und der Gesamtspermienzahl bei Männern aus Nordamerika, Europa und Australien zwischen 1973 und 2011 aufgedeckt. Dieser Rückgang, der auf 50–60% geschätzt wird, betrifft Männer unabhängig von ihrem Fruchtbarkeitsstatus, ohne Anzeichen einer Stabilisierung in den letzten Jahren. Diese Ergebnisse deuten stark auf eine bedeutende Verschlechterung der männlichen reproduktiven Gesundheit hin, mit Auswirkungen, die über Fruchtbarkeitsbedenken hinausgehen (Levine H et al., 2017). Angesichts des Ausmaßes dieser globalen Verschiebung ist die überzeugendste Erklärung eine, die alle beteiligten Bevölkerungen universell betrifft. Es besteht kein Zweifel an den erheblichen Auswirkungen, die neue Lebensstiländerungen auf uns haben können. Es ist gut dokumentiert, dass das Rauchen von Tabak eine breite Palette physiologischer Funktionen negativ beeinflusst. Darüber hinaus stellt der Gebrauch von Tabak und Cannabis eine zunehmende Bedrohung für die männliche reproduktive Gesundheit dar. Obwohl die Prävalenz des Tabakrauchens im Laufe der Zeit bei Männern im fortpflanzungsfähigen Alter gesunken ist, hat der Gebrauch anderer eingeatmeter Produkte wie Cannabis zugenommen. Daher ist es entscheidend für das Wohlergehen zukünftiger Generationen, ihre potenziell schädlichen Auswirkungen auf die männliche Fruchtbarkeit zu verstehen. Zahlreiche Studien der letzten Jahrzehnte haben einen Zusammenhang zwischen dem Rauchen von Tabak oder Cannabis und einem Rückgang der Spermienqualität aufgezeigt, der potenziell zur männlichen Unfruchtbarkeit führt. Tabakrauchen, eine weltweit verbreitete Erscheinung, beeinträchtigt nicht nur das Wohlbefinden eines Einzelnen, sondern auch seine genetische Beschaffenheit erheblich. In den letzten Jahren haben umfangreiche Forschungen die komplexe Beziehung zwischen Tabakexposition und der Expression zahlreicher Gene untersucht. In jüngster Zeit hat sich der Cannabiskonsum nach der Legalisierung von Marihuana in verschiedenen Ländern und Bundesstaaten verändert, und es ist ein unerlässliches öffentliches Gesundheitsproblem aufgetreten, das sich nicht nur auf die Benutzer, sondern auch auf ihre Nachkommen auswirkt. Die Wahrnehmung der Cannabistoxizität und -sicherheit in Gesellschaft, Politik und sogar in wissenschaftlichen Kreisen hat sich in den letzten Jahrzehnten dramatisch verändert. Daraus ergeben sich einige Fragen zu den Auswirkungen von Marihuana (Cannabis sativa) auf die menschliche Physiologie und reproduktive Gesundheit auf kurze und lange Sicht. Das Ziel dieser Studie war es daher, die Auswirkungen von Tabak- und Cannabiskonsum auf die Spermienqualität, die Chromatinintegrität und den oxidativen Schaden bei Männern, die zuvor jährlich Tabak oder Cannabis konsumiert haben, zielt die Studie darauf ab, die Schäden zu untersuchen, die Tabak und Cannabis sowie ihre Bestandteile auf mitochondriale genetische Varianten der Spermien in den Cytochrom-C-Oxidase-1-, 2- und 3-Genen (MT-CO1, MT-CO2 und MT-CO3) verursachen. Speziell auf die Veränderungen im durch das Zytochromoxidase -kodierte Gen innerhalb der Spermienmitochondrien. Zunächst wurden 10 Samenproben einer in-vitro-Studie unterzogen, indem die Spermaparameter (Volumen, Spermienzahl, Beweglichkeit) innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme analysiert wurden, gemäß den WHO-Kriterien 2020. Zur Erzielung genauer Ergebnisse wurde ein computergestütztes Spermaanalyse (CASA) -System zur Bestimmung der Spermaparameter verwendet. Jede Probe wurde mit 1 mL; 10 μg/mL THC, THC-COOH und CBD in Methanol gelöst, belichtet. Alle Proben wurden auch mit 1 mL reinem Methanol als Kontrollgruppe belichtet, um die potenziellen Auswirkungen von Methanol auf Samenzellen zu eliminieren. Mehrere Abstriche (10 μL) jeder Probe wurden genommen, um die Funktionalität das Chromatin verdichten geschlechtsreifer Spermatozoen unter Verwendung von Chromomycin blaue (CMA3) und Desoxyribonukleinsäure Spaltung (Acridinorang) -Analysen zu bewerten. Anschließend wurden insgesamt 116 Proben von Männern unter 40 Jahren in Prince Rashid Bin Al Hassan Hospital (PRBH) in Irbid, Jordanien, gesammelt. Die Proben wurden in drei Gruppen unterteilt: Gruppe 1 - Nichtraucher (Kontrollgruppe, n = 38), Gruppe 2 (n = 39) - Tabak starke Raucher, mehr als 10 Zigaretten pro Tag für mindestens 5 Jahre, und Gruppe 3 - Cannabis Raucher (n = 37) mit mindestens 4 Joints pro Woche für mehr als 3 Jahre. Die Chromatin verdichten und der DNA schaden wurde durch Verwendung von Chromomycin CMA₃ und Acridin Orang-Färbung bewertet. Der 8-OHG-RNA-Test wurde verwendet, um den oxidativen Schaden zu messen. Darüber hinaus wurde das gesamte Genom der Spermatozoen unter Verwendung eines QIAamp-DNA-Mini-Kits extrahiert und die mitochondriale DNA unter Verwendung des REPLI-g mitochondrial DNA Kit amplifiziert. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um das MT-CO1-, MT-CO2- und MT-CO3-Gen zu amplifizieren. Anschließend wurden die Proben gereinigt und unter Verwendung der Sanger-Methode sequenziert. Die Behandlung von Samenzellen mit 10 μL THC, THC-COOH und CBD führte zu einem signifikanten Rückgang der Gesamtspermienmotilität nach der Exposition gegenüber THC und CBD (P ≤ 0,001 bzw. P ≤ 0,003). Die progressive Motilität wurde signifikant reduziert (P ≤ 0,001) und die durchschnittliche Anzahl von unbeweglichen Spermien stieg signifikant an (P ≤ 0,003) Anschließend zeigte sich nur eine leichte Reduktion der Gesamtspermienmotilität nach der Inkubation mit THC-COOH. In vivo hingegen zeigten die Samenanzahl und die progressive Motilität keinen signifikanten Unterschied zwischen den untersuchten Gruppen (Nichtraucher, Tabakraucher und Cannabisraucher). Der Mittelwert der unbeweglichen Spermatozoen und morphologisch abnormen Spermatozoen erhöhte sich jedoch bei Rauchern und Cannabisrauchern gegenüber Nichtrauchern (52,42% für Tabakraucher, 65,13% für Cannabisraucher und 44,59% für Nichtraucher). Bei den Rauchern für Tabak und Cannabisraucher betrug er entsprechend (5,02 bzw. 2,23 und 7,34). Außerdem zeigte der Mittelwert der Chromatinkondensation der Samenzoen unter den Nichtrauchern (14,68 ± 15,64), den Tabakrauchern (25,28 ± 14,86; P ≤ 0,024) und den Cannabisrauchern (34,83±18,39; P ≤ 0,001) einen statistisch signifikanten Unterschied. Eine kumulative Summe von 22 einzelnen Nukleotidpolymorphismen (SNPs) wurde im mitochondriellen Zytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 1 (Mt-Co1) -Gen gefunden, mit einer Verteilung von 37,8 %, 64,1 %, and 54 % bei Nichtrauchern, Tabakrauchern und Cannabisrauchern, respektive. Auf der anderen Seite wurden 17 Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) im mitochondriell codierten Zytochrom-C-Oxidase-II (MT-CO2) -Gen identifiziert, mit einem Anteil von 21,62 %, 28,2 %, and 43,24 % bei Nichtrauchern, Tabakrauchern und Cannabisrauchern, respektive. Im mitochondriell codierten Zytochrom-c-Oxidase-III-Gen (Mt-Co3) wurden insgesamt 20 einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) identifiziert, mit einer Verteilung von 54,05 %, 64,1 %, and 51,35 % bei den untersuchten Gruppen - Nichtrauchern, Tabakrauchern und Cannabisrauchern, respektive. Dennoch gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Gruppen in Bezug auf diese SNPs. Diese Studie zeigt, dass Tabak- und Cannabisrauchen einen negativen Einfluss auf Spermienparameter, Chromatin-Kondensation (Spermienreife) und die DNA-Integrität von Spermatozoen haben und bei Männern im reproduktiven Alter vermieden werden sollten. Sie unterstreicht auch die Bedeutung der Förderung von Bildung und Bewusstsein in Bezug auf den Cannabiskonsum und seine umfangreichen Auswirkungen, die sich nicht nur auf die individuelle Gesundheit, sondern auch auf das Wohlergehen zukünftiger Generationen.