Etablierung einer methodischen Vorgehensweise zur Konservierung humaner Immunzell-Proben für die nachfolgende Analyse mittels Einzelzell-Sequenzierung

Abstract

Ein wichtiger Bestandteil des menschlichen Immunsystems machen die PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells; mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) aus. Dabei handelt es sich um im peripheren Blut zirkulierende Immunzellen mit nur einem einzelnen runden Zellkern [29]. Durch die Aktivierung von PBMCs findet die Lymphozyten Proliferation, eine Veränderung der exprimierten mRNA und eine veränderte Zytokin-Produktion statt [38]. Weitere Immunreaktionen bestehen beispielsweise in der vermehrten Produktion von Antikörper durch B-Zellen [22] und in der Phagozytose von pathogenen Antigenen durch dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen und B-Zellen, welche diese daraufhin CD4+-T-Zellen präsentieren [15]. Die molekularbiologische Analyse der PBMCs bietet die Möglichkeit eines Einblickes in die komplexen Zusammenhänge immunologischer Signalketten und das Erkennen von Hinweisen auf immun-gekoppelte Veränderungen, welche zu Infektionen [1] und Erkrankungen wie Krebs [61] führen können. Für eine detaillierte Darstellung der immunologischen Vorgänge ist als neuste molekularbiologische Untersuchungsmethoden die Einzelzell-RNA-Sequenzierung besonders geeignet [1], wobei im Anschluss eine Zelltypbestimmung der heterogenen Zellprobe anhand zelltyp-spezifischer molekularer Marker vorgenommen werden kann. Insbesondere bei nur in geringer Anzahl vorkommenden molekularen Markern kann dies allerdings eine Herausforderung darstellen [47]. Durch die Aktivierung durch externe Stimuli werden zelltyp-spezifische Marker nachweislich vermehrt induziert [7]. Basierend darauf bestand ein zentrales Ziel dieser Arbeit in der Testung, ob eine zuvor erfolgte in vitro Aktivierung bei der Auswertung von Einzelzell-Sequenzierungsanalysen zuverlässiger auf die spezifischen Zelltypen rückschließen lässt. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden PBMCs aus dem peripher venösen Blut von vier exemplarischen Spenderinnen isoliert und eine in vitro Aktivierung mittels PMA und Ionomycin durchgeführt. Nach Analyse mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurden die resultierenden Einzelzell-Daten den verschiedenen Zelltypen anhand spezifischer Marker zugeordnet und in Form von UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) Clustern visualisiert. In Folge der Aktivierung waren Größe und Definierbarkeit der verschiedenen Cluster ausgeprägter. Am Beispiel der T-Helfer-Zellen konnte zudem gezeigt werden, dass spezifische Marker, wie beispielsweise der Transkriptionsfaktor BATF, nach Aktivierung eine Steigerung der Expression aufwiesen. Insgesamt konnte somit der Nutzen der Aktivierung von PBMCs für die Aufschlüsselung der Zelltypen bestätigt werden. Um die komplexen Arbeitsabläufe zur Analyse von PBMC-Aktivierungsmustern für zukünftige PBMC-Aktivierungsstudien zu erleichtern, bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, ein Arbeitsprotokoll zu evaluieren, welches die Zwischenlagerung der Zellen nach definierten Arbeitsschritten vorsah. Nach der Isolation aus dem Blut wurden die PBMCs in ein DMSO-basiertes Kryomedium aufgenommen und zunächst als vitale Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Nach dem Auftauen und im Anschluss an die in vitro Aktivierung wurden die Zellproben mithilfe eines Methanol-basierten Verfahrens fixiert, um sie vor der Analyse mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung erneut zwischenlagern zu können. Ein wichtiger Bestandteil der Arbeit waren die regelmäßigen Qualitätskontrollen nach den einzelnen Zwischenlagerungen. So wurden nach Auftauen der kryokonservierten Zellen und nach Anfärbung der toten Zellen mit Trypanblau ein Anteil vitaler Zellen von mehr als 80 % ermittelt. Am Beispiel der T-Zellen, welche die größten Zellpopulation der PBMCs darstellen [38], konnte zudem mittels Fluoreszenzfärbung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse die effektive Induktion des CD69 Oberflächenproteins nachgewiesen werden, welches als früher Marker des T-Zell-Aktivierungsprozesses gilt [84]. Außerdem konnte eine im Referenzbereich liegende Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen bestätigt werden. Nach dem letzten Schritt der Einzelzell-Sequenzierung wurde die Qualität der resultierenden Daten anhand bestimmter Parameter wie zum Beispiel dem Anteil der intrazellulären Reads, der Anzahl der detektierten Gene pro Zelle [25] und der Expression von mitochondrialen Genen [23] überprüft. Auf Grundlage des Anteils der mitochondrialen Gene sowie der empfohlenen Grenzwerte für Gene und UMIs pro Zelle musste insgesamt nur ein sehr geringer Anteil der untersuchten Einzelzellen von den nachfolgenden Analysen ausgeschlossen werden. Für die in die finalen Auswertungen eingeschlossenen Zellen, lagen sowohl die mediane Anzahl an Genen pro Zelle als auch die mediane Anzahl an UMIs pro Zelle in einem Bereich, der anhand von vorangegangenen Studien vergleichbaren Werten von frisch isolierten PBMCs entsprach [23][25][34]. Darüber hinaus konnten anhand der resultierenden Einzelzell-Daten veränderte Expressionsraten von Genen mit bezeichnender immunregulatorischer Funktion nachgewiesen werden. In Folge der in vitro Aktivierung konnte beispielsweise eine erhöhte Expressionsrate des NFKB1 Gens nachgewiesen werden. Das zugehörige Genprodukt fungiert als zentraler Transkriptionsfaktor, der die vermehrte Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen und Adhäsionsmolekülen fördert [14]. Analog zu den durchflusszytometrischen Analysen, kann auf Grundlage der Expressionsdaten somit ebenfalls von der effektiven Induktion der Immunzellaktivierung ausgegangen werden. Insgesamt kann auf Basis der hohen Zellvitalität, der erwartungsgemäßen Verteilung T-zellulärer Subtypen und anhand der Evaluierung der resultierenden Einzelzell- Sequenzierungsdaten somit von der Eignung des zu testenden Versuchsprotokolls für die Analyse von PBMC-Einzelzell-Aktivierungsmustern ausgegangen werden.

PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) are an important component of the human immune system. These are immune cells circulating in the peripheral blood with only a single round cell nucleus [29]. The activation of PBMCs leads to a change in lymphocyte proliferation, a change in the expression of mRNA and a change in cytokine production [37]. Other immune responses include an increased antibody production by B cells [22] and the phagocytosis of pathogenic antigens by dendritic cells, monocytes, macrophages and B cells, which in the following present them to CD4+ T cells [15]. Molecular biological analysis of PBMCs offers the possibility of gaining insight into the complex interrelationships of immunological signalling chains and the recognition of indications of immune-linked changes that can lead to infections [1] and diseases such as cancer [60]. Single-cell RNA sequencing is the latest molecular biological examination method that is particularly suitable for a detailed representation of immunological processes [1], whereby the cell type of the heterogeneous cell sample can then be determined using cell-type-specific molecular markers. However, this can pose a challenge, especially when the number of molecular markers is low [46]. Activation by external stimuli has been shown to increase the induction of cell type-specific markers [7]. Based on this, a central aim of this work was to test whether previous in vitro activation can be used to more reliably infer the specific cell types when analysing single-cell sequencing analyses. In the present study, PBMCs were isolated from the peripheral venous blood of four exemplary donors and activated in vitro using PMA and ionomycin. After analysis by single-cell RNA sequencing, the resulting single-cell data were assigned to the different cell types using specific markers and visualised in the form of UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) clusters. As a result of the activation, the size and definability of the different clusters were more pronounced. Using the example of T helper cells, it was also shown that specific markers, such as the transcription factor BATF, exhibited an increase in expression after activation. Overall, the benefit of activating PBMCs for the breakdown of cell types was thus confirmed. In order to facilitate the complex workflows for analysing PBMC activation patterns for future PBMC activation studies, a further aim of the present work was to evaluate a work protocol that provided for the intermediate storage of the cells after defined work steps. After isolation from the blood, the PBMCs were placed in a DMSO-based cryomedium and initially cryopreserved as vital cells in liquid nitrogen. After thawing and following in vitro activation, the cell samples were fixed using a methanol-based process so that they could be temporarily stored again before being analysed using single-cell RNA sequencing. An important part of the work was the quality controls after the individual interim storages. After thawing the cryopreserved cells and staining the dead cells with trypan blue, a proportion of vital cells of more than 80 % was determined. Using the example of T cells, which represent the largest cell population of PBMCs [37], the effective induction of the CD69 surface protein, which is considered an early marker of the T cell activation process, was also demonstrated by means of fluorescence staining and subsequent flow cytometric analysis [83]. In addition, the number of CD4+ and CD8+ T cells was confirmed to be within the reference range. After the final step of single-cell sequencing, the quality of the resulting data was checked using certain parameters such as the proportion of intracellular reads, the number of genes detected per cell [25] and the expression of mitochondrial genes [23]. Based on the proportion of mitochondrial genes and the recommended limit values for genes and UMIs per cell, only a very small proportion of the individual cells examined had to be excluded from the subsequent analyses. For the cells included in the final analyses, both the median number of genes per cell and the median number of UMIs per cell were in a range that corresponded to comparable values of freshly isolated PBMCs based on previous studies [23][25][33]. In addition, the resulting single-cell data revealed altered expression rates of genes with significant immunoregulatory functions. As a result of in vitro activation, for example, an increased expression rate of the NFKB1 gene was detected. The associated gene product acts as a central transcription factor that promotes the increased release of pro-inflammatory cytokines and adhesion molecules [14]. Analogous to the flow cytometric analyses, the effective induction of immune cell activation can also be assumed on the basis of the expression data. Overall, based on the high cell viability, the expected distribution of T-cell subtypes and the evaluation of the resulting single-cell sequencing data, it can be assumed that the experimental protocol to be tested is suitable for analysing PBMC single-cell activation patterns.